Методические указания к лабораторным работам и вопросы для самостоятельной подготовки студентов 2-го курса эколого-биологического факультета
|
|
Скачать 1.18 Mb.
|
|
^
2. Определение содержания холестерола в сыворотке крови В пробирку вносят 2 мл реактива Илька и 0,1 мл сыворотки крови. Содержимое перемешивают, закрывают пробкой и ставят в темное место на 20 минут, после чего колориметрируют, как при построении калибровочной кривой. Определяют концентрацию холестерола в сыворотке крови по полученной калибровочной кривой. Результаты: Общие выводы по работе: работа 17. определение концентрации общего холестерола в сыворотке и плазме крови энзиматическим методом ^ ознакомиться с одним из самых распространенных в клинической биохимии методов определения холестерола. Задачи:
^ При гидролизе эфиров холестеридов холестеролэстеразой образуется холестерол. Общий холестерол (свободный и этерифицированный) окисляется кислородом воздуха под действием холестеролоксидазы с образованием эквимолярного количества пероксида водорода:  В присутствии пероксидазы перекись водорода окисляет фенол, который превращается в бензохинон, имеющий розовый цвет. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации холестерола. Реактивы Из набора реагентов серии Olvex Diagnosticum готовят перед анализом:
а) фосфатный буфер (100 ммоль/л), б) фенол (20 ммоль/л), в) холестеролэстеразу (400 U/л), г) холестеролоксидазу (250 U/л), д) пероксидазу (500 U/л). ^ В три обычные химические пробирки наливают: 1) в опытную – 0,02 мл сыворотки (или плазмы) крови, 2) в стандартную – 0,02 мл стандартного раствора холестерола, Во все пробирки добавляют по 2 мл рабочего реагента, реакционную смесь тщательно перемешивают и пробы помещают в термостат на 5 минут при 37 оС. Затем измеряют оптическую плотность опытной и стандартной проб против контроля в кюветах с рабочей длиной 5 мм (или 3 мм) при длине волны 490-500 нм. Окраска проб стабильна в течение 2 часов при условии отсутствия воздействия прямых солнечных лучей. Расчет. Расчет количества общего холестерола проводят по формуле: С = Ео/Ест. 5,17 [ммоль/л] или С = Ео/Ест. 200 [мг/100мл], где Ео – экстинция опытной пробы, Ест – экстинция стандарта. Содержание холестерола в сыворотке крови здоровых людей разного возраста колеблется в пределах: 20-29 лет – 3,72- 7,11 ммоль/л (144-175 мг/дл), 30-39 лет – 4,27-7,63 ммоль/л (165-295 мг/дл), 40-49 лет – 4,40- 8,15 ммоль/л (170-315 мг/дл), старше 50 лет – 4,58-8,79 ммоль/л (177-340 мг/дл). Результаты: Общие выводы по работе: работа 18. количественное определение холестерола липопротеинов высокой плотности в сыворотке крови человека ^ ознакомиться с современным и самым распространенным в клинической биохимии методом определения -холестерола в сыворотке крови. Задачи:
^ Хиломикроны (ХМ), липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП) и липопротеины низкой плотности (ЛПНП) осаждаются фосфорновольфрамовой кислотой и Mg2+ и отделяются центрифугированием. Липопротеины высокой плотности (ЛПВП) остаются в надосадочной жидкости (супернатанте) и количество холестерола в них определяется также, как концентрация общего холестерола энзиматическим методом. Реактивы 1. Осаждающий реагент, содержащий фосфорновольфрамовую кислоту и катионы Mg2+, 2. Стандартный раствор холестерол – 1,29 ммоль/л (50 мг/дл). 3. Рабочий реагент, содержащий: а) фосфатный буфер (100 ммоль/л), б) фенол (20 ммоль/л), в) холестеролэстеразу (400 U/л), г) холестеролоксидазу (250 U/л), д) пероксидазу (500 U/л). Ход работ. а) Осаждение ЛПОНП и ЛПНП В три центрифужные пробирки наливают:
Во все пробирки добавляют по 0,3 мл осаждающего реагента. Содержимое пробирок тщательно перемешивают и оставляют на 10 минут при комнатной температуре. Затем опытную пробу центри-фугируют в течение 15 минут при 3000 оборотах в минуту и прозрачный центрифугат используют для определения холестеролна ЛПВП (-холестерола). Стандартную и контрольную пробы можно не центрифугировать. б) Определение концентрации -холестерола В три обычные химические пробирки (опытную, стандартную и контрольную) аккуратно автоматической пипеткой переносят по 0,2 мл жидкости из соответствующих центрифужных пробирок и добавляют по 2,0 мл рабочего реагента. Реакционную смесь тщательно перемешивают, и пробы помещают в термостат на 5 минут при 37 оС. Затем измеряют оптическую плотность опытной и стандартной пробы против контроля в кюветах на 5 мм при длине волны 490-500 нм. Расчет 1. Концентрацию холестерола ЛПВП (-холестерола) рассчитывают по формуле: С = Е0/Ест. 1,29 [ммоль/л] или С = Е0/Ест. 50 [мг/дл], где Е0 и Ест. – экстинкции опытной и стандартной проб. 2. Расчет холестеринового индекса атерогенности (ХИА) проводят по формуле: ХИА = (общий холестерол – -холестерол) / -холестерол В норме величина холестеринового индекса атерогенности 3,0. Результаты: Общие выводы по работе: ^ Цель работы: ознакомиться с некоторыми реакциями выявления кетоновых тел в биологических жидкостях. Задачи:
^ Ацетон и ацетоуксусная кислота образуют с нитропруссидом натрия в щелочной среде комплексное соединение розово-фиолетовой окраски. Интенсивность окраски зависит от количества кетоновых тел в реакции. ^ Ход работы. На кафель или стекло наносят 0,1-0,2 г порошка, прибавляют 2-3 капли сыворотки крови и выдерживают 5 минут. Появление розово-фиолетовой окраски указывает на положительный результат. Минимальный уровень кетоновых тел в крови, дающий положительную реакцию, равен 10 мг/100 мл (10 мг%). Скорость развития окраски и ее интенсивность пропорциональны концентрации кетоновых тел в исследуемой пробе: если фиолетовое окрашивание возникает немедленно – содержание 50-80 мг% и более; если оно появляется через 1 минуту – в пробе содержится 30-50 мг%; развитие слабой окраски через 3 минуты свидетельствует о присутствии 10-30 мг% кетоновых тел. |
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям