«Микробиологическая диагностика стафилококковых и стрептококковых инфекций»
|
|
Скачать 2.73 Mb.
|
|
Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Северо-Осетинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии. МИКРОБИОЛОГИЯ, ВИРУСОЛОГИЯ И ИММУНОЛОГИЯ Часть 2 (Учебное пособие для студентов стоматологического факультета) Владикавказ, 2010 г. СОСТАВИТЕЛИ: Л.Я. Плахтий – д.м.н., профессор, зав. кафедрой микробиологии ГОУ ВПО СОГМА Росздрава. А.Ч. Цховребов – к.м.н., ассистент кафедры микробиологии ГОУ ВПО СОГМА Росздрава. РЕЦЕНЗЕНТЫ: В.Н. Царев – д.м.н., профессор, зав. кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии МГМСУ. С.В. Сирак – д.м.н., профессор, зав. кафедрой стоматологии ФПО СтГМА. Занятие № 1. Тема занятия: «Микробиологическая диагностика стафилококковых и стрептококковых инфекций». ^
Студент должен знать:
Студент должен уметь:
^
^
а) учет результатов посева культуры стафилококка и стрептококка на кровяной агар, цель определения гемолизина. б) учет результатов посева в цитратную плазму для определения плазмокоагулазы. в) учет результатов посева на желточно-солевой агар с целью определения лецитиназы. г) учет результатов посева на среду с маннитом.
^  Рис. Колонии стрептококков и стафилококков на питательной среде. Семейство Staphilococcoceae, род Staphilicoccus. Это мелкие грамположительные кокки. В мазках располагаются скоплениями, часто гроздевидными. Спор не образуют, неподвижны. Образуют микрокапсулы. Являются факультативными анаэробами. Нетребовательны к питательным средам, хорошо растут на простых средах, дают пигментные колонии. Элективной средой для стафилококков является желточно-солевой агар, режемолочно-солевой агар. Стафилококки устойчивы к действию высоких концентраций хлорида натрия. В отличие от микрококков стафилококки способны разлагать глюкозу в анаэробных условиях, глицерин в аэробных условиях. Они чувствительны к лизостафину, так как в состав их клеточной стенки входят особые тейхоевые кислоты рибитолтейхоевые. Стафилококки активны биохимически, обладают протеолитической и сахаролитической активностью. По биохимическим свойствам делятся на виды:
Для дифференциации этих трех видов используют три теста:
Для St. aureus все три теста положительны, для St. saprophiticus все три теста отрицательны, St. epidermidis чувствителен к новобиоцину. Стафилококки могут вызывать оппортунистические, в том числе внутрибольничные инфекции. Наибольшее клиническое значение наряду с «традиционными» видами — Staphylococcus aureus (золотистым), Staphylococcus epidermidis (эпидермальным) и Staphylococcus saprophyticus (сапрофитическим) — имеют так называемые коагулазоотрицательные стафилококки (S. haemolyticus, S. lugdunensis, S. schleiferi, S. warneri). Внутрибольничные инфекции часто обусловлены метициллинрезистентными S. aureus (MRSA), имеющими повышенную вирулентность и устойчивость ко многим антимикробным препаратам. При заболеваниях, вызванных стафилококками, исследуют гной, раневое отделяемое, пунктаты из полостей и абсцессов, материал со слизистых оболочек, кровь, мокроту, мочу, спинномозговую жидкость; в случае пищевых отравлений — рвотные массы, испражнения больных, остатки пищи; при профилактических исследованиях — смывы с инструментов и оборудования, стерилизованные материалы медицинского назначения, воздух. При заболеваниях полости рта материал берут ватным тампоном после удаления верхнего слоя гноя, в котором могут находиться непатогенные стафилококки и другие микроорганизмы, попавшие с кожи или из воздуха. При наличии закрытых гнойных очагов делают пункцию и выливают гной из шприца в стерильную пробирку. Отделяемое слизистой оболочки снимают сухим тампоном. Мочу, мокроту собирают в стерильные пробирки и банки. Кровь (5 — 20 мл), взятую шприцем из локтевой вены, и спинномозговую жидкость с соблюдением правил асептики сеют у постели больного во флакон, содержащий 100 — 200 мл сахарного бульона (рН 7,2 — 7,4), или на среду для контроля стерильности. Стафилококки хорошо размножаются и на простых средах, однако лучше использовать обогащенные среды, так как септицемия может быть вызвана не только стафилококками, но и прихотливыми микроорганизмами (стрептококками, анаэробами и др.). Микроскопия. Гной, мокроту, отделяемое зева и другие материалы, содержащие высокие концентрации возбудителя, подвергают световой микроскопии. Гной густой консистенции вносят в каплю стерильной воды, делают мазок тампоном или петлей и окрашивают по Граму. Шаровидные клетки стафилококков окрашиваются в сине-фиолетовый цвет и располагаются небольшими скоплениями, попарно или короткими цепочками. Микроскопия не может служить единственным методом лабораторной диагностики, так как не позволяет с уверенностью дифференцировать, например, стафилококки и стрептококки, поэтому наряду с микроскопическим проводят бактериологическое исследование материала. ^ В 1-й день исследования петлей или шпателем материал засевают в чашки с 5%м кровяным, а также желточно или молочносолевым агаром, которые инкубируют 18 — 24 ч при 37 °С и столько же — на свету при комнатной температуре (для более четкого пигментирования колоний). Солевые среды ввиду высокого содержания хлорида натрия являются селективными для стафилококков, рост большинства сопутствующих микроорганизмов на них подавляется. На 2й день изучают выросшие колонии: стафилококки образуют выпуклые, ровные непрозрачные колонии средней величины белого, лимонно-желтого или золотистого цвета (гемолитические или негемолитические). Пигментообразование лучше заметно на молочно-солевом агаре. На желточно-солевом агаре большая часть патогенных стафилококков вызывает лецитиназную (лецитовителлазную) реакцию, проявляющуюся в образовании вокруг колонии зоны помутнения с радужным венчиком в отраженном свете. При микроскопии в мазках обнаруживают грамположительные кокки, расположенные гроздьями. Для выделения чистой культуры подозрительные колонии пересевают на скошенный МПА. На 3й день проверяют чистоту выделенной культуры, ставят тесты и делают посевы для ее идентификации. Обязательно определяют чувствительность штамма к антибиотикам, а при необходимости — фаговар (с использованием набора типовых стафилококковых бактериофагов). На 4й день проводят окончательную идентификацию культур по культурально-морфологическим, биохимическим тестам, чувствительности к антибиотикам и др. Для выделения гемокультуры стафилококков посев крови в сахарном бульоне выдерживают при 37 °С в течение 18 — 24 ч. Стафилококк вызывает равномерное помутнение среды. На 2й день (или позже, в зависимости от темпов размножения) из бульонной культуры готовят и микроскопируют окрашенные по Граму мазки, затем пересевают ее на скошенный МПА и в чашку с кровяным агаром для выявления гемолитической активности. На 3й день получают культуру на скошенном агаре и изучают так же, как культуру, выделенную из гноя или других материалов. Для посева экссудата, гноя из невскрывшихся абсцессов, флегмон используют МПА или 5%й кровяной агар, инкубируют при 37 °С в течение 18 — 24 ч, выделяют чистую культуру и проводят ее идентификацию вышеописанными методами. При пищевых отравлениях исследуемый материал микроскопируют, затем сеют в чашки с МПА и в бульон, содержащий 1 % глюкозы (для обогащения). Материал, загрязненный сопутствующей микрофлорой, засевают на кровяной агар, содержащий 6 — 7 % хлорида натрия. На такой среде подавляется рост энтеробактерий и бацилл, а стафилококки растут хорошо и проявляют гемолитическую активность. Посевы инкубируют при 37 °С. На следующий день изучают колонии, выделяют и, далее, идентифицируют чистые культуры. Стафилококки, вызывающие пищевые отравления, образуют золотистый, реже белый пигмент, вызывают гемолиз и коагулируют плазму. Стафилококки могут находиться в воздухе операционных перевязочных, родильных палат и других больничных помещений. Для их обнаружения делают посевы воздуха на желточно-солевой агар. К 100 мл расплавленного МПА, содержащего 7,5 г хлорида натрия, добавляют 20 мл стерильной желточной взвеси, перемешивают и разливают в чашки. Для приготовления желточной взвеси желток куриного яйца асептически извлекают, отмывают от белка, помещают во флакон с бусами, добавляют 200 мл ИХН и встряхивают до полного смешивания; хранят в холодильнике. ^ Для подтверждения стафилококковой инфекции серодиагностика имеет вспомогательное значение. Определение стафилококкового антитоксина в сыворотке крови при диагностике хронических стафилококковых инфекций (остеомиелит, септикопиемия и др.) имеет большее значение, так как бактериологические исследования, проводимые на фоне массивной антибиотикотерапии, как правило, остаются безрезультатными. Можно использовать РИГА с эритроцитарным стафилококковым диагностикумом (эритроциты нагружены атоксином стафилококка). В основе другой реакции лежит метод подавления гемолитической активности стафилококкового токсина антитоксином сыворотки больного. Для этого к определенной дозе стафилококкового токсина прибавляют сыворотку больного, разведенную 1 : 5, 1:10, 1:15, 1 :20 и т.д., тщательно перемешивают и к смеси добавляют 0,05 мл эритроцитов кролика. Результаты реакции учитывают после инкубирования пробирок в течение 1 ч при температуре 37 "С и такого же периода при комнатной температуре. Количество сыворотки, в смеси с которым гемолиз слабый или не обнаруживается, считают ее титром. У практически здоровых детей, так же как и у лиц, перенесших, например стафилококковую инфекцию кожи, титр стафилококкового антитоксина не превышает 0,5 — 4 АЕ/мл. У больных с хроническими стафилококковыми инфекциями титр, как правило, выше.  ^ Стафилококки полости рта. Отдел Firmicutes, семейство Micrococcaceae, род Staphylococcus. В род Staphylococcus по классификации Байрд— Паркер входят 3 вида: S. aureus, S. epidermidis и S. saprophyticus. Предложенные недавно другие классификации включают большее количество видов стафилококков, но они используются пока только в научных исследованиях. Все виды стафилококков представляют собой округлые клетки диаметром 0,5—1 мкм. В мазке располагаются обычно несимметричными гроздьями («гроздья винограда»), но встречаются одиночные клетки, пары клеток. Грамположительны. Спор не образуют, жгутиков не имеют. У некоторых штаммов можно обнаружить капсулу. Могут образовывать L-формы. Клеточная стенка содержит большое количество пептидогликана, связанных с ним тейхоевых кислот, протеин А. Стафилококки хорошо растут на простых средах (рН 7,0—7,5); факультативные анаэробы. На плотных средах образуют гладкие круглые выпуклые колонии с различным пигментом. Пигмент не имеет таксономического значения. Могут расти на агаре с высоким содержанием (8—10 %) NaCl. Продуцируют сахаролитические и протеолитические ферменты. Стафилококки вырабатывают гемолизины, фибринолизин, фосфатазу, р-лактамазу, бактериоцинины, энтеротоксины, коагулазу, ДНК-азу, лейкоцидины, лецитовителлазу и др. Стафилококки очень пластичны: быстро вырабатывают устойчивость к антибактериальным препаратам. Существенную роль в этом играют плазмиды, передающиеся с помощью трансдуцирующих фагов от одной клетки к другой. R-плазмиды детерминируют устойчивость к одному или нескольким антибиотикам, в том числе и за счет экстрацеллюлярной продукции р-лактамазы — фермента, разрушающего пенициллин, разрывающего его р-лактамное кольцо. Возбудителем стафилококковых инфекций чаще бывает S. aureus, несколько реже — S. epidermidis, очень редко — S. saprophyticus. Стафилококки являются представителями нормальной микрофлоры человеческого тела, поэтому микробиологическая диагностика стафилококковых инфекций не может ограничиться выделением и идентификацией возбудителей; необходимы количественные методы исследования, т. е. определение числа микроорганизмов в пробе. Стафилококки в полости рта здорового человека встречаются в среднем в 30 % случаев. В зубном налете на деснах здоровых людей присутствуют в основном Stapf. epidermidis. Значительно чаще патогенные стафилококки локализуются на слизистой глотки и носа, обусловливая так называемое "здоровое бактерионосительство". Обладая ферментативной активностью, стафилококки принимают участие в расщеплении остатков пищи в полости рта. Такие постоянные носители патогенного стафилококка являются источником воздушно-капельной инфекции. Патогенные стафилококки, встречающиеся на слизистой носоглотки и в полости рта являются частой причиной аутоинфекции, вызывая различные гнойно-воспалительные процессы полости рта. Лечение стафилококковых инфекций обычно проводят антибиотиками и сульфаниламидными препаратами. В последние годы от больных часто выделяют стафилококки, резистентные к большинству химиотерапевтических препаратов. В таких случаях для лечения используют антитоксическую противостафилококковую плазму или иммуноглобулин, полученные из крови доноров, иммунизированных стафилококковым анатоксином. Для активной иммунизации (плановых хирургических больных, беременных женщин) может быть использован адсорбированный стафилококковый анатоксин.  Рис. Колонии на гемин-агаре и морфология клеток Parph. Gingivalis. Стрептококки Относятся к семейству Streptococcaceae, роду Streptococcus. Это грамположительные кокки, в мазках располагаются цепочками или попарно. Являются факультативными анаэробами. Не растут на питательных средах. На кровяном агаре дают мелкоточечные беспигментные колонии, окруженные зоной гемолиза: а — зеленящий, прозрачный. Заболевание чаще вызывается гемолитическим стрептококком. В сахарном бульоне дают придонно-пристеночный рост, а сам бульон остается прозрачным. Растут при температуре 37 °С. Стрептококки способны расщеплять аминокислоты, белки, углеводы. По биохимическим свойствам выделяют 21 вид. Большинство из них условно-патогенные. Наибольшее значение в развитии инфекционных заболеваний имеют:
Хотя многочисленные представители рода Streptococcus в норме составляют значительную долю нормальной микрофлоры пищеварительного, дыхательного и генитального тракта, некоторые из них могут вызывать оппортунистические инфекции разной локализации и тяжести: фарингиты, ангины, отиты, пневмонии, скарлатину и другие заболевания дыхательного тракта и ЛОР-органов; рожистое воспаление, флегмоны, нагноения ран и другие заболевания кожи и подкожной клетчатки; послеродовые гнойно-воспалительные осложнения, менингит, сепсис. Тяжелыми осложнениями стрептококковой инфекции являются ревматизм и гломерулонефрит. При заболеваниях, вызванных стрептококками, материалом для исследования, в зависимости от локализации и формы инфекции, являются гной, кровь, отделяемое слизистой оболочки, моча, мокрота, спинномозговая жидкость, раневое отделяемое. Берут его так же, как при заболеваниях, вызванных стафилококками. При взятии материала из полости рта ополаскивание не проводят, а интервал после приема пищи должен быть не менее 2 ч. Если материал невозможно доставить в лабораторию в течение 2 ч, его помещают в транспортные среды или среду накопления (сахарный бульон, тиогликолевая среда). Микроскопия. В мазках из гноя, отделяемого слизистой оболочки, окрашенных по Граму, стрептококки располагаются короткими цепочками, иногда в виде диплококков или единичных кокков. В последнем случае стрептококки нельзя отличить от стафилококков, поэтому для более детального изучения обнаруженных кокков обязательно проводят бактериологическое исследование. Это необходимо и для правильного выбора препаратов этиотропного лечения. В качестве экспресс-диагностики иногда стрептококки определяют в нативном материале методом иммунофлюоресценции. ^ Гной, отделяемое слизистой оболочки, мочу, мокроту, спинномозговую жидкость сеют в чашку Петри с 5%м кровяным агаром (лучше использовать дефибринированную баранью кровь) и в пробирку с сахарным бульоном. Для выделения стрептококков из контаминированного материала используют селективные среды (в кровяной агар и среду накопления вводят антибиотики — колистин, налидиксовую кислоту, которые подавляют рост сопутствующих микроорганизмов). Хотя стрептококки дают рост на воздухе, посевы лучше инкубировать в анаэробной атмосфере при 37 "С. Инкубация в атмосфере СО2 стимулирует рост бетагемолитических стрептококков, не относящихся к группе А. С этими целями применяют анаэростат или эксикатор с горящей свечой. Через 24 — 48 ч изучают колонии и рост в сахарном бульоне. В сахарном бульоне большинство пиогенных стрептококков дает придонный или пристеночный рост в виде хлопьев или зерен, вся среда остается прозрачной, другие стрептококки могут давать интенсивное помутнение среды с образованием компактного осадка. На плотных средах Streptococcus pyogenes растет с образованием нескольких типов колоний: мелких, плоских, суховатых колоний зернистой структуры (вирулентные штаммы, содержащие Мпротеин); относительно крупных, блестящих, вязких с ровным краем (вирулентные, содержащие капсулу). По росту на кровяных средах выделяют три группы стрептококков: гемолитические (вызывают полный гемолиз эритроцитов с обесцвечиванием и просветлением среды вокруг колоний), агемолитические (вызывают неполный гемолиз с формированием зеленоватой зоны вокруг колоний, обусловленной образованием метгемоглобина) и негемолитические (среда вокруг колоний не изменена). «Зеленящие» стрептококки образуют блестящие или матовые мелкие колонии сероватого цвета. Негемолитические стрептококки, как правило, не имеют клинического значения. В окрашенных мазках из колоний стрептококков не отмечается типичного расположения кокков в виде цепочек. Клетки располагаются одиночно, попарно или небольшими скоплениями. В мазке из культуры в жидкой среде обнаруживают типичные цепочки стрептококков. Подозрительные колонии пересевают на кровяной агар или в бульонную среду для накопления чистой культуры и ее дальнейшей идентификации. В ходе идентификации учитывают культурально-морфологические особенности культуры, ставят каталазный тест, определяют группу, вид и серовар стрептококка. Группы стрептококка классифицируют по наличию полисахаридного антигена, для выявления которого используют реакцию преципитации с групповыми сыворотками {А, В, Си т.д.). Подавляющее большинство стрептококков группы А относятся к виду S. pyogenes, поэтому нередко данные названия используют как синонимы. Для быстрого определения группы стрептококка применяют реакцию латексагглютинации или коагглютинации с диагностикумами, «нагруженными» антителами соответствующих групповых сывороток (реакцию ставят с антигенными экстрактами из исследуемого материала или культур на различных этапах бактериологического исследования). Большинство клинически значимых стрептококков относится к группе А. Чувствительность стрептококков к антибиотикам во многом прогнозируема, однако появляются сообщения об устойчивости некоторых штаммов, в частности, к пенициллинам, поэтому у выделенной культуры проверяют чувствительность к антимикробным препаратам. ^ Посев крови в сахарный бульон или специальную среду для выделения гемокультур стафилококков производят так же, как при стафилококковых заболеваниях. При наличии стрептококка на дне флакона появляется хлопьевидный придонный осадок. В мазках обнаруживаются длинные цепочки стрептококков. Микроскопия позволяет дать предварительный ответ о наличии или отсутствии стрептококка. Для выделения чистой культуры и определения характера гемолиза делают пересев в чашку с кровяным агаром. Через сутки (3й день исследования) появляются типичные мелкие колонии, окруженные зоной гемолиза. Дальнейшие этапы исследования описаны выше. Для диагностики скарлатины, как правило, лабораторные исследования не применяют. В отдельных случаях высевают отделяемое слизистой оболочки зева и выделяют стрептококки различных серогрупп. ^ Серодиагностику стрептококковых инфекций проводят у больных хронически текущими заболеваниями, леченных большими дозами антибиотиков и сульфаниламидных препаратов, т. е. когда выделение возбудителя бактериологическими методами представляет большие трудности, а также при оценке активности ревматического процесса, выявлении микробоносительства. Она предусматривает определение в крови специфических стрептококковых антител к токсинам, в частности к стрептолизину О и гиалуронидазе. Стрептококки являются основными обитателями полости рта. В 1 мл слюны содержится до 108 - 109 стрептококков. Тем не менее, в пробах слюны их примерно в 2 раза больше, чем в материале из бляшки или десневого желобка. Наиболее значительной группой стрептококков полости рта следует считать микроаэрофильные а-гемолитические ("зеленящие") стрептококки и негемолитические формы. Следует отметить, что от 40 - 90 % штаммов вида milled могут быть В-гемолитическими, которые принимают активное участие в процессах, приводящих к поражениям твердых тканей зуба и пародонта. В эту группу входят Streptococcus mutants, S. sanguis, S. mitis, S. salivarium. Они отличаются друг от друга по способности ферментировать углеводы и образовывать перекись водорода. Сдвиг рН в кислую сторону приводит к декальцинации зубной эмали. Особо следует подчеркнуть высокие способности микроаэрофильных стрептококков к аггрегации с другими бактериями, которые показаны, в частности, в отношении актиномицетов, фузобактерий, лактобактерий. Все это способствует обнаружению данных видов в составе ассоциаций возбудителей при различных гнойно-воспалительных процессах в челюстно-лицевой области. Но особенно значительна их роль в развитии кариеса. Ведущее место в этом плане занимают два вида, активно продуцирующие из углеводов пищи молочную и другие кислоты на эмали -S. mutans и S. sanguis. Все виды стрептококков плохо растут и погибают на простых питательных средах, т.к. в процессе роста и размножения стрептококки выделяют много перекиси водорода, которая действует на них губительно, т.к. они не продуцируют каталазу. Для создания оптимальных условий роста к питательной среде обычно добавляют кровь, в которой содержится каталаза, разрушающая перекись водорода. На кровяных средах стрептококки хорошо растут в аэробных условиях, при этом одни из них образуют на кровяном агаре колонии, окруженные зоной полного гемолиза (это гемолитические (В) стрептококки), другие окружены зоной зеленоватого цвета (зеленые стрептококки), у третьих (у) гемолиз отсутствует (негемолитические стрептококки). Стрептококки выделяют экзотоксин и ферменты агрессии. Во внешней среде менее устойчивы, чем стафилококки. Большинство чувствительны к пенициллину и другим антибиотикам. По антигенной структуре все стрептококки делят на 17 серологических групп (A,B,C,D, .... и до S), чаше других в полости рта обнаруживаются стрептококки групп А, С, D, F, G, Н и О.  ^ Стрептококки полости рта. Отдел Firmicutes, семейство Streptococcaceae, род Streptococcus. В род Streptococcus входят более 20 видов, среди которых есть представители нормальной микрофлоры человеческого тела и полости рта, а также возбудители тяжелых инфекционных эпидемических заболеваний человека. Стрептококки — мелкие (меньше 1 мкм) шаровидные клетки, располагающиеся цепочками или попарно, грамположительны, спор не образуют, неподвижны. Большинство штаммов стрептококков образуют капсулу, состоящую из гиалуроновой кислоты. Клеточная стенка содержит белки (М-, Т- и R-антигены), углеводы (группоспецифические) и пептидогликаны. Легко переходят в L-формы. Генетический обмен возможен за счет трансформации и трансдукции, но не конъюгации. Устойчивость к антибиотикам вырабатывается медленно. Стрептококки группы А вырабатывают более 20 внеклеточных веществ, обладающих антигенной активностью. Наибольшее значение в патогенезе стрептококковых инфекций имеют:
Стандартизованный разведенный эритрогенин используют при постановке внутрикожной пробы (проба Дика) для выявления чувствительности к этому токсину (восприимчивость к скарлатине). Стрептококки являются основными обитателями полости рта. В 1 мл слюны содержится до 108 - 109 стрептококков. Тем не менее, в пробах слюны их примерно в 2 раза больше, чем в материале из бляшки или десневого желобка. Наиболее значительной группой стрептококков полости рта следует считать микроаэрофильные а-гемолитические ("зеленящие") стрептококки и негемолитические формы. Следует отметить, что от 40 - 90 % штаммов вида milled могут быть В-гемолитическими, которые принимают активное участие в процессах, приводящих к поражениям твердых тканей зуба и пародонта. В эту группу входят Streptococcus mutants, S. sanguis, S. mitis, S. salivarium. Они отличаются друг от друга по способности ферментировать углеводы и образовывать перекись водорода. Сдвиг рН в кислую сторону приводит к декальцинации зубной эмали. Особо следует подчеркнуть высокие способности микроаэрофильных стрептококков к аггрегации с другими бактериями, которые показаны, в частности, в отношении актиномицетов, фузобактерий, лактобактерий. Все это способствует обнаружению данных видов в составе ассоциаций возбудителей при различных гнойно-воспалительных процессах в челюстно-лицевой области. Но особенно значительна их роль в развитии кариеса. Ведущее место в этом плане занимают два вида, активно продуцирующие из углеводов пищи молочную и другие кислоты на эмали -S. mutans и S. sanguis. Все виды стрептококков плохо растут и погибают на простых питательных средах, т.к. в процессе роста и размножения стрептококки выделяют много перекиси водорода, которая действует на них губительно, т.к. они не продуцируют каталазу. Для создания оптимальных условий роста к питательной среде обычно добавляют кровь, в которой содержится каталаза, разрушающая перекись водорода. На кровяных средах стрептококки хорошо растут в аэробных условиях, при этом одни из них образуют на кровяном агаре колонии, окруженные зоной полного гемолиза (это гемолитические (В) стрептококки), другие окружены зоной зеленоватого цвета (зеленые стрептококки), у третьих (у) гемолиз отсутствует (негемолитические стрептококки). Стрептококки выделяют экзотоксин и ферменты агрессии. Во внешней среде менее устойчивы, чем стафилококки. Большинство чувствительны к пенициллину и другим антибиотикам. По антигенной структуре все стрептококки делят на 17 серологических групп (A,B,C,D, .... и до S), чаше других в полости рта обнаруживаются стрептококки групп А, С, D, F, G, Н и О.  Рис. Колонии на гемин-агаре и морфология клеток Prev. Intermedia. Ситуационные задачи: 1. При микроскопическом исследовании отделяемого фурункула выделен S. аureus. К какой группе представителей нормальной микрофлоры кожи относится этот микроорганизм? 2. На каких из перечисленных сред выращивают стафилококки и каике среды целесообразно использовать при проведении бактериологического исследования? а) МПБ или МПА; б) молочно-солевой агар в) желчный бульон г) кровяной агар д) сахарный агар или бульон е) желчно-солевой агар 3. Какая среда является селективной для стрептококков? Что обеспечивает селективность этой среды? 4. Каковы особенности строения клеточной стенки стафилококков и стрптококков по сравнению со строением клеточной стенки грамотрицательных бактерий? 5. Какие ферменты патогенности продуцируют стафилококки? Какова их роль в патогенезе инфекции? 6. Какие клетки, кроме эритроцитов, может повреждать ₤ - токсин? 7. Чем объясняют кардиотоксический, дерматотоксический и нейротоксический эффекты α - токсина? Занятие № 2. Тема занятия: «Микробиологичеакая диагностика гонококковых и менингококковых инфекций». ^
Студент должен знать:
Студент должен уметь:
^
^
^ Менингококки. Менингококки относятся к роду Neisseria, род N. meningitidis. Это диплококки бобовидной формы, в мазках имеют вид кофейных зерен. Спор не образуют, жгутиков не имеют, в организме образуют капсулу. Грамотрицательные. Строгие аэробы. Менингококки требовательны к питательным средам — растут только на средах, содержащих человеческий белок (сывороточный агар, асцитагар), при температуре 37 °С. На сывороточном агаре образуют нежные прозрачные колонии средней величины. В сывороточном бульоне дают рост в виде помутнения и осадка на дне. Биохимически малоактивны, ферментируют только глюкозу и мальтозу, образуя кислоту, но не образуя газ. Крайне неустойчивы во внешней среде, чувствительны к перемене температуры, погибают при температуре ниже 37 °С. По капсульному полисахаридному антигену менингококки подразделяют на четыре основные серогруппы (группы А, В, С, D) и три дополнительные (X, Y, Z). Клинические формы могут быть различными: менингококковый назофарингит, цереброспинальный менингит, менингококкцемия (менингококковый сепсис), менингококковый эндокардит и др. После перенесенного заболевания формируется стойкий видоспецифический антимикробный иммунитет. У детей младшего возраста имеется пассивный иммунитет, обусловленный полученными от матери IgG. Диагностика:
3) серодиагностика: РПГА с парными сыворотками (для диагностики генерализованных форм инфекции). Лечение: этиотропная терапия: сульфаниламиды, пенициллины, хлорамфеникол. Специфическая профилактика: химическая менингококковая вакцина, содержащая поли сахаридные антигены серогрупп А и С (активный антимикробный иммунитет); человеческий иммуноглобулин (пассивный антимикробный иммунитет). Менингококковую инфекцию вызывают менингококки — Neisseria meningitidis (бактерии 3й группы патогенности). Материалом для исследования служит отделяемое носоглотки, спинномозговая жидкость, кровь, соскоб из элементов геморрагической сыпи на коже, секционный материал. Менингококки очень чувствительны к колебаниям температуры, поэтому материал сразу же сеют на питательные среды или немедленно, не допуская охлаждения, отправляют в лабораторию, где до посева сохраняют в термостате. Отделяемое слизистой оболочки носовой части глотки снимают специальным клювовидным (изогнутым под углом) тампоном. Наиболее результативным является немедленный посев носоглоточной слизи на плотные питательные среды с тщательным разобщением бактериальных клеток. Если время доставки в лабораторию превышает 3 ч., то тампон помещают в пробирку с 3 мл среды обогащения (содержит 0,1 % агарагара, 20% сыворотки и 20 ЕД/мл ристомицина) и ставят в термостат при 37 °С (после подращивания материал высевают на сывороточный агар). Микроскопия. Микроскопическое исследование спинномозговой жидкости и крови дает возможность определить наличие возбудителя. Если спинномозговая жидкость имеет вид гноя, то мазки готовят без ее предварительной обработки; при незначительной мутности спинномозговую жидкость центрифугируют и из осадка делают мазки. Окрашивают их по Граму, водным раствором основного фуксина и/или метиленовым синим. При окраске по Граму форменные элементы спинномозговой жидкости могут изменяться, что осложняет обнаружение возбудителя. Менингококки имеют вид диплококков бобовидной формы, соприкасающихся вогнутыми краями и расположенных внутри цитоплазмы лейкоцитов. Часто обнаруживается нежная капсула. При менингококцемии менингококки иногда можно обнаружить в мазках крови. Для этого готовят препарат толстой капли и без фиксации окрашивают его 2 — 3 мин водным раствором метиленовой сини, лишнюю окраску смывают водопроводной водой и высушивают пре, парат на воздухе. На голубом фоне препарата видны окрашенные в темносиний цвет лейкоциты, а между ними множество мелких, темносиних кокков, расположенных в виде кучек, парно или по одному. Экспресс-диагностика основана на обнаружении в спинномозговой жидкости или крови больного специфического антигена, Осуществляется с помощью латексагглютинации, ИФА, встречного иммуноэлектрофореза с групповыми преципитирующими сыворотками. Эти методы приобретают особое значение при неэффективности микроскопической диагностики и посевов. ^ Менингококк растет на питательных средах с нативным белком (бульон или агар сывороткой, асцитической жидкостью или кровью). Для исследования материала, обильно контаминированного нормофлорой мазки из носоглотки), применяют посев на плотные селективыс среды с антибиотиками (ристомицином, ванкомицином и нистатином). Спинномозговую жидкость лучше сеять после центрифугирования (3000 об/мин в течение 5 мин). Засевают 2 — 3 капли полученного осадка на поверхность подогретой питательной среды в чашке и инкубируют при 37 "С в атмосфере с повышенным содержанием СО2 (используют СО2инкубатор, газогенераторные пакеты или эксикатор с зажженной свечой). Остаток спинномозговой жидкости используют для РВИЭФ и других методов индикации возбудителя. Как правило, одновременно с прямым посевом материал засевают на среду обогащения (например, полужидкую сывороточную среду) с последующим пересевом на плотные среды для выделения чистой культуры. На 2 —3й день инкубации менингококки образуют мелкие, круглые, выпуклые, прозрачные колонии. В мазках, приготовленных из этих колоний, обнаруживают полиморфные диплококки и тетракокки (картина настолько пестрая, что создается впечатление смешанной культуры). Колонии пересевают на скошенный сывороточный агар. Если в «прямых» посевах материала рост отсутствует, культуру выделяют из спинномозговой жидкости, залитой полужидким агаром (со среды обогащения). На 3й день исследования для идентификации чистой культуры у нее выявляют оксидазную активность и делают посев на среды с углеводами. Менингококки обладают оксидазой, ферментируют глюкозу и мальтозу с образованием кислоты, лактозу, сахарозу и фруктозу не ферментируют, полисахарид из сахарозы не образуют, не растут в присутствии 0,2% желчи. Для выявления оксидазной активности на кусочек фильтровальной бумаги, смоченной каплей свежеприготовленного 1%го раствора солянокислого парадиэтилфенилендиамина, петлей наносят культуру менингококков. Культуры, обладающие оксидазной активностью, в течение 30 — 60 с вызывают вначале порозовение, а затем почернение бумаги с реактивом. Для определения способности образовывать полисахарид культуры нейссерий засевают на бескрахмальную среду с 1 % сахарозы и инкубируют при 37 °С в течение 24 — 48 ч, после чего на рост наносят каплю йодного раствора Люголя. В случае образования полисахарида сразу развивается буро-лиловое окрашивание. Для дифференциации менингококка и непатогенных нейссерий (Neisseria mucosa, Neisseria sicca и др.) используют свойство последних расти на простых питательных средах, а также способность образовывать колонии при комнатной температуре (22 °С). Для обнаружения менингококка в крови во флаконы с 50 мл бульона, содержащего 0,1 % агарагара, засевают 5 —10 мл крови, асептически взятой из вены. Через сутки делают пересев культуры на сывороточный агар. Выделение и идентификация культур осуществляются таким же образом, как и при исследовании спинномозговой жидкости. ^ Серодиагностику применяют в качестве вспомогательного метода (в основном для эпидемиологического анализа). Ставят РНГА с эритроцитами, нагруженными группоспецифическими полисахаридными АГ или ИФА с теми же антигенами.  ^ Гонококки Относятся к роду Neisseria, вид N. gonorrhoeas. Это диплококки бобовидной формы, в мазках располагаются внутриклеточно в протоплазме лейкоцитов, имеют вид кофейных зерен. Спор не образуют, неподвижны, образуют микрокапсулу, грамотрицательные. Являются облигатными аэробами. Гонококки исключительно требовательны к питательным средам, растут только на средах, содержащих человеческие белки (сывороточном агаре, асцитагаре и др.). На сывороточном агаре образуют мелкие блестящие колонии в виде капель.
^ — антропонозная инфекция, источник заражения — больной человек, носительства не бывает. Путь передачи половой, возможно заражение новорожденного при прохождении через родовые пути больной матери. Клинические формы гонококковой инфекции:
По длительности течения гонореи и выраженности клинических признаков различают: 1) свежую гонорею (длительность течения не более 2 месяцев): а) острую; б) подострую; в) торпидную; 2) хроническую гонорею (вялотекущее заболевание продолжительностью более 2 месяцев или с неустановленным сроком). По клиническому течению различают:
Перенесенное заболевание не оставляет стойкого иммунитета. Диагностика: 1) при острой форме: а) бактериоскопия мазка отделяемого уретры, шейки матки; б) бактериологическое исследование; 2) при хронической форме: а) бактериоскопия; б) бактериологическое исследование; в) серодиагностика — РСК; г) иммуноиндикация. Особенность серодиагностики: диагноз ставится качественно по обнаружению в сыворотке обследуемого антител) по результатам однократной реакции (без парных сывороток). Это объясняется тем, что постинфекционный иммунитет при гонорее не формируется (нет постинфекционных антител). ^ Готовят не менее двух мазков на предметном стекле. Мазки фиксируют в фиксирующей жидкости и окрашивают щелочным раствором метиленового синего и по Граму. При микроскопии гонококки имеют вид бобовидных грамотрицательных диплококков, расположенных, подобно менингококкам, внутри клеток (нейтрофильных гранулоцитов), а также внеклеточно. Окраска по Граму позволяет дифференцировать гонококки со стафилококками и другими бактериями. При хронической гонорее в мазках обнаруживается большое количество сопутствующих микроорганизмов, а морфология возбудителя может меняться: наблюдаются диплококки с неодинаковыми по величине и форме клетками. При неадекватном лечении сульфаниламидами и антибиотиками происходят значительные изменения формы и величины гонококков: крупные шаровидные, величиной до размеров эритроцита, либо мелкие пылевидные — Lформы. В связи с тем, что в исследуемом материале могут находиться и другие грамотрицательные бактерии, сходные с гонококками, применяют методы индикации. Так, мазки обрабатывают флюоресцирующими антителами против гонококков и при люминесцентной микроскопии наблюдают свечение клеток гонококков (прямая РИФ). Бактериоскопическое исследование, особенно при хронической, леченой гонорее, а также гонорее у женщин не всегда дает положительный результат, поэтому используют другие методы диагностики. ^ Его проводят в тех случаях, когда гонококки в мазках не обнаруживают или находят нетипичные, измененные формы. Культуральное исследование необходимо для контроля излеченности, при диагностике заболевания у детей, для судебномедицинской экспертизы. Ввиду особой чувствительности гонококка к охлаждению материал для исследования по возможности не транспортируют. Кроме того, гонококк очень чувствителен ко многим антимикробным веществам, поэтому за 1 —2 дня до посева необходимо исключить применение больным антисептиков и прекратить антибактериальную терапию. При хронической гонорее перед исследованием для повышения вероятности выявления возбудителя проводят провокацию биологическим методом: однократное внутримышечное введение гоновакцины взрослым в количестве 500 млн микробных тел, детям старше 3х лет — 100 — 200 млн микробных тел, детям старше 3х лет — 100 — 200 млн микробных тел. Детям до 3х лет гоновакцину не вводят. Провокация может быть также термической, механической и алиментарной. Посев производят непосредственно после взятия материала. Для культивирования гонококка используют МПА (рН 7,4) с добавлением асцитической жидкости — асцитагар. Применяются также среды следующего состава, мл: Среда № 1 МПА из кроличьего мяса или бычьих сердец, рН 7,4 — 7,5 100 Гидролизат казеина 2 Дрожжевой аутолизат 2 Сыворотка крови крупного рогатого скота 20 Среда № 2 МПА из кроличьего мяса, рН 7,4 100 Гемогидролизат 2 Дрожжевой аутолизат 2 Сыворотка крови крупного рогатого скота 20 Среда № 3 МПА из кроличьего мяса, рН 7,4 100 Среда 199 20 Дрожжевой аутолизат 2 Сыворотка крови крупного рогатого скота 20 Среда № 4 МПА из кроличьего мяса, рН 7,4 100 Куриный желток 10 Сыворотка крови крупного рогатого скота 20 Для подавления роста сопутствующей микрофлоры в среду рекомендуется добавить антибиотики: полимиксин М (25 ЕД/мл среды), ристомицина сульфат (20 ЕД/мл среды). Если нет возможности начать бактериологическое исследование на месте, для сохранения жизнеспособности гонококков материал после взятия помещают в транспортные среды, хранят при 4— 15 "С не более 24 ч, а затем пересевают на вышеуказанные среды. Посевы культивируют при 37 °С в атмосфере с 10 % СО2. Гонококк дает рост обычно через 24 ч в виде мелких колоний, напоминающих росу, бесцветных или слегка желтоватых. Края колонии ровные, поверхность блестящая и гладкая. Характерным признаком является ранний аутолиз центральной части колоний. Выделенные чистые культуры идентифицируют по морфологическим, тинкториальным и биохимическим свойствам. Основные дифференциально-диагностические свойства гонококков представлены выше. У выделенных культур обязательно проверяют чувствительность к антимикробным препаратам, в первую очередь пенициллинам. ^ Серодиагностику проводят при хронической гонорее, когда у больного отсутствуют выделения и провести бактериоскопическое или бактериологическое исследование не представляется возможным. В этих случаях сыворотку крови больного исследуют в РСК или РНГА со стандартным гонококковым антигеном. ПЦР. В настоящее время разработаны тестсистемы для ПЦРдиагностики гонококковой инфекции, по чувствительности и специфичности превосходящие культуральный метод, в том числе при использовании проб, взятых неинвазивными методами (например, мочи). При этом имеется возможность выявления генов антибиотикоустойчивости у штаммов N. gonorrhoeae. Широко внедряется в практику комбинированный тест (мультиплексная ПЦР) для выявления Neisseria gonorrhoeae, Chlamidia trachomatis и Trichomonas vaginalis. |
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям