«Микробиологическая диагностика стафилококковых и стрептококковых инфекций»
|
|
Скачать 2.73 Mb.
|
|
^ Микоплазмы — уникальная группа мелких плеоморфных широко распространенных в природе грамотрицательных микроорганизмов, отличающихся от остальных бактерий полным отсутствием клеточной стенки. Впервые с этой группой мельчайших бактерий столкнулся Л. Пастер, изучая плевропневмонию крупного рогатого скота. Его возбудитель имеет настолько малые размеры, что он не виден под микроскопом, к тому же он не растет на обычных питательных средах, поэтому Л. Пастеру не удалось его выделить. Лишь в 1898г. Е. Нокар и Э. Ру, используя сложную питательную среду, смогли получить культуру возбудителя плевропневмонии, а в 1931г. У. Эльфорд с помощью бактериальных фильтров определил размеры этого микроорганизма — 125-150нм. У микоплазм нет клеточной стенки. Они не способны синтезировать предшественников пептидогликана (мураминовую и диаминопимелиновую кислоты) и окружены лишь тонкой трехслойной мембраной толщиной 7,5-10 нм. Поэтому их выделили в особый отдел Tenericutes, класс Mollicutes («нежная кожа»), порядок Mycoplasmatales. Последний включает ряд семейств, в том числе Mycoplasmataceae. К этому семейству относятся патогенные микоплазмы (вызывают заболевания у людей, зверей и птиц), условно-патогенные (очень часто бессимптомными носителями их являются культуры клеток) и микоплазмы-сапрофиты. Микоплазмы — наиболее мелкие и просто организованные прокариоты, способные к автономному размножению, а минимальные элементарные тельца, например Acholeplasma laldlawli, по размерам сопоставимы с минимальной исходной клеткой-прогенотой. Размер генома у микоплазм — самый маленький для прокариот, например, у членов семейства Mycoplasmataceae он составляет 0,45 МД. В связи с этим микоплазмы имеют целый ряд особенностей: очень малые размеры (100-450нм), благодаря чему многие микоплазмы могут проходить (фильтроваться) через бактериальные фильтры; наличие минимальных количеств органелл (цитоплазматическая мембрана, нуклеоид, рибосомы); отсутствие многих биосинтетических процессов, имеющихся у других бактерий; малые размеры колоний, образующихся на плотных средах (0,1-0,6мм); нечувствительность к бета-лактамным антибиотикам и другим агентам, угнетающим синтез клеточной стенки (из-за ее отсутствия); плеоморфизм, высокая осмотическая чувствительность. Морфология их различна — шаровидные, вакуолизированные, нитевидные (нередко ветвящиеся), гранулярные (элементарные тельца) структуры. Обычно неподвижные, но некоторые виды обладают скользящей подвижностью. Размножаются путем бинарного поперечного деления шаровидных и нитевидных (фрагментация) клеток, почкования и высвобождения множества элементарных телец, образующихся в нитях. Большинство видов микоплазм для роста нуждаются в стеролах и включают их непосредственно в свою трехслойную мембрану, которая состоит главным образом из липидов и белков. Поэтому микоплазмы являются паразитами мембран эукариотных клеток и способны длительное время персистировать на мембранах различных клеток человека, млекопитающих, птиц, рыб, моллюсков, насекомых и растений. Микоплазмы размножаются на бесклеточных питательных средах, но для своего роста большинство из них нуждается в холестерине, который является уникальным компонентом их мембраны (даже у микоплазм, не требующих для своего роста стеролов), в жирных кислотах и нативном белке. Для выделения культур могут быть использованы жидкие и плотные питательные среды. Рост в жидких средах сопровождается едва видимым помутнением, на плотных средах с дрожжевым экстрактом и лошадиной сывороткой формирование колоний происходит следующим образом. В связи с их малыми размерами и отсутствием ригидной клеточной стенки микоплазмы способны проникать с поверхности агара и размножаться внутри его — в промежутках между нитями агара. При нанесении капли материала, содержащего микоплазмы, она проникает через имеющуюся на поверхности агара водную пленку и адсорбируется агаром, образуя небольшое уплотнение между его нитями. В результате размножения микоплазм, приблизительно через 18 ч, внутри сплетенных нитей агара формируется маленькая сферическая колония под поверхностью агара; она растет, и через 24-48 ч инкубации достигает поверхностной водной пленки, в результате чего образуются две зоны роста — мутный гранулярный центр, врастающий в среду, и плоская ажурная полупросвечивающая периферическая зона (вид «глазуньи»). Колонии мелкие, диаметром от 0,1 до 0,6мм, но могут быть и меньшего (0,01мм) и большего (4,0мм) диаметра. На кровяном агаре очень часто вокруг колоний наблюдаются зоны гемолиза, обусловленного действием образующейся Н2О2. Колонии некоторых видов микоплазм способны адсорбировать на своей поверхности эритроциты, эпителиальные клетки различных животных, клетки культур тканей, сперматозоиды человека и некоторых животных. Адсорбция лучше происходит при 37 °С, менее интенсивно — при 22 °С и специфически угнетается антисыворотками. Температурный оптимум для роста микоплазм 36-37 °С (диапазон 22-41 °С), оптимальная рН 7,0 или слегка кислая, или слегка щелочная. Большинство видов — факультативные анаэробы, хотя лучше растут в аэробных условиях, некоторые виды — аэробы; немногие — лучше растут в анаэробных условиях. Микоплазмы неподвижны, но отдельные виды обладают скользящей активностью; являются хемоорганотрофами, в качестве главного источника энергии используют либо глюкозу либо аргинин, редко — оба вещества, иногда — ни то, ни другое. Они способны ферментировать галактозу, маннозу, гликоген, крахмал с образованием кислоты без газа; протеолитическими свойствами не обладают, лишь некоторые виды разжижают желатин и гидролизуют казеин. Антигенная специфичность микоплазм определяется антигенами цитоплазматической мембраны, в частности, содержащимися в ней белками и гликопротеидами. Микоплазмы обладают родо-, видо- и типоспецифическими антигенами. Кроме того, они могут иметь антигены, общие с антигенами мембран клеток-хозяев или включают их в результате длительной персистенции на мембранах этих клеток, что может стать причиной антигенной мимикрии и привести к развитию аутоиммунной патологии. Резистентность. Из-за отсутствия клеточной стенки микоплазмы более чувствительны, чем другие бактерии, к воздействию механических, физических и химических факторов (УФ-облучению, действию прямых солнечных лучей, рентгеновскому облучению, изменению рН среды, к действию высокой температуры, высушиванию). При нагревании до 50 °С погибают в течение 10—15 мин, очень чувствительны к обычным химическим дезинфектантам. Семейство микоплазм насчитывает более 100 видов. Человек является естественным носителем не .менее 13 видов микоплазм, которые вегетируют на слизистых оболочках глаза, дыхательных, пищеварительных и мочеполовых путей. В патологии человека наибольшую роль играют несколько видов Mycoplasma: M.pneumoniae, M.hominis, M.arthritidis, M.fermentans и, возможно, M.genitalium, и единственный вид рода Ureaplasma — U.urealyticum. Основное биохимическое отличие последнего от видов Mycoplasma заключается в том, что U.urealyticum обладает уреазной активностью, которой лишены все члены рода Mycoplasma Патогенные для человека микоплазмы вызывают у него заболевания (микоплазмозы) дыхательных, мочеполовых путей и суставов с разнообразными клиническими проявлениями. ^ Респираторный микоплазмоз имеет глобальное распространение. По данным ВОЗ (1985г.), ежегодно болеет 8—15 млн человек. Очень часто протекает в виде острой пневмонии (сегментарной, очаговой или интерстициальной). Основной возбудитель — M.pneumoniae, значительно реже — M.hominis, и очень редко заболевание дыхательных путей у детей в возрасте до 1 года вызывает U.urealyticum. M.pneumoniae. Основные биологические и морфологические свойства типичны для рода Mycoplasma, однако имеется ряд отличительных признаков. По форме это короткие нити длиной 2~5мкм, клетки обладают скользящей подвижностью. Размножаются путем бинарного деления и высвобождения элементарных телец из нитей. Свежеизолированные колонии часто лишены полупрозрачной периферической зоны, а имеют вид приподнятой кольцевидной гранулярной структуры диаметром 30-100мкм. Растут медленнее, чем другие микоплазмы. Колонии появляются через 5—10 дней инкубации, иногда позднее. Требуется несколько последовательных пересевов, чтобы колонии приобрели вид «глазуньи». Колонии на плотной среде адсорбируют эритроциты, трахеальные эпителиальные клетки обезьян, крыс, морских свинок, кур, клетки некоторых культур, а также сперматозоиды человека и быков. Рецепторы эритроцитов и эпителиальных клеток для M.pneumoniae разрушаются нейраминидазой; адсорбция клеток предотвращается, если микоплазмы обработать предварительно нейраминовой кислотой. M.pneumoniae вызывает гемагглютинацию эритроцитов человека и животных, обладает гемолитической активностью, обусловленной продукцией H2O2; митогенным действием в отношении Т- и В-лимфоцитов и цитотоксическим действием; высокочувствительна к эритромицину. В антигенном отношении вид M.pneumoniae представляет однородную группу, типоспецифических антигенов не обнаружено. Резистентность к действию физических и химических факторов невелика. ^ высокое сродство к эпителиальным клеткам дыхательных путей, гемадсорбционные, гемолитические, цитотоксические свойства микоплазм, их подвижность. Эпидемиология. Источником инфекции является больной человек, а также носители, в том числе перенесшие болезнь в бессимптомной форме. Заражение происходит воздушно-капельным путем, так как возбудитель локализуется главным образом на клетках реснитчатого эпителия дыхательных путей. Респираторный микоплазмоз — малоконтагиозное заболевание, что объясняется кратковременным сроком выживания возбудителя во внешней среде, поэтому для заражения требуется тесное и длительное общение с источником инфекции. Этим и обусловливается более высокая заболеваемость в организованных коллективах, в особенности во вновь организованных, где через 2—3 мес заражается до 50% его членов. Болеют чаще лица в возрасте от 1 года до 30 лет. ^ Инкубационный период длится 7-14 дней, иногда до 25 дней. Возбудитель адсорбируется на слизистой оболочке верхних дыхательных путей, размножается и активно распространяется по слизистой оболочке трахеи и бронхов, достигает альвеолоцитов, внедряется в межальвеолярные перегородки. В результате повреждения клеток возникают перибронхиальные, периваскулярные и интерстициальные инфильтраты. Для микоплазменной пневмонии, которая развивается обычно постепенно, типичен сухой или со скудной мокротой длительный изнуряющий кашель; физикальные изменения в легких выражены слабо или отсутствуют, поэтому пневмония выявляется при рентгенологическом исследовании. Воспалительные инфильтраты рассасываются медленно — в течение 3-4 нед, иногда дольше. У детей раннего возраста нередко наблюдается двустороннее поражение легких. Течение болезни, как правило, доброкачественное. ^ после острой инфекции сохраняется в течение 5-10 лет, иногда дольше. Он обусловлен как секреторными, так и гуморальными антимикробными антителами, а также сохраняющимися более продолжительный срок антителами, подавляющими метаболизм микоплазм, и клеточными элементами (макрофаги, Т-лимфоциты). После бессимптомных и стертых форм инфекции иммунитет кратковременный и слабо выражен. ^ Поскольку атипические пневмонии имеют различную этиологию, решающая роль в их диагностике принадлежит лабораторным методам. Для диагностики респираторного микоплазмоза (микоплазменной пневмонии) используют бактериологические и серологические методы, а также выявление микоплазм и их идентификацию с помощью иммунологических приемов. Материалом для бактериологического исследования служат мокрота, слизь из глотки, плевральная жидкость, лаваж (от франц. lavage — промывать, смывы с поверхности бронхиол и альвеолярных структур легких, полученные при бронхоскопии). Для получения культур посевы производят на среды, содержащие все необходимые для роста микоплазм питательные вещества. Для угнетения роста сопутствующих бактерий в питательную среду добавляют пенициллин и ацетат таллия, к которым M.pneumoniae устойчива. Выделенную культуру идентифицируют на основании морфологических, культуральных свойств, признаков, а также с помощью диагностических иммунных сывороток, полученных путем иммунизации кроликов препаратами цитоплазматических мембран M.pneumoniae. Микоплазмы и их антигены могут быть обнаружены в исследуемом материале с помощью иммунофлуоресценции, РПГА, РАГА, ИФМ. Кроме того, для идентификации микоплазм используют еще 2 теста: угнетение роста и угнетение метаболизма, которые достигаются с помощью специфических антител. Для серологической диагностики применяют РПГА, РСК, иммунофлуоресценцию, ИФМ с использованием специфической гликолипидной фракции мембран M.pneumoniae. Нарастание титра антител определяют в парных сыворотках. В качестве одного из ускоренных методов может быть использована и внутрикожная проба с аллергеном из M.pneumoniae. Для выявления M.pneumoniae разработана и предложена тест-система на основе ЦПР, позволяющая обнаружить носительство микоплазм даже в тех случаях, когда они не обнаруживаются никакими другими методами. Лечение. При острой форме микоплазменной пневмонии наиболее эффективно применение эритромицина и тетрациклинов. Профилактика. Неспецифическая профилактика такая же, как в отношении острых респираторных вирусных заболеваний. Для специфической профилактики разрабатываются инактивированные вакцины, химические вакцины (из антигенов цитоплазматической мембраны M.pneumoniae), а также живые вакцины из аттенуированных штаммов возбудителя. Микоплазмы — возбудители урогенитальных заболеваний Воспалительные болезни мочеполовой системы, такие как уретриты, циститы, гломерулонефриты, пиелонефриты, простатиты; у женщин — вагиниты, сальпингиты, кольпиты, цервициты, эндометриты, параметриты, этиологически очень часто связаны с микоплазмами, особенно с М.hominis и U.urealyticum. Этими видами микоплазм инфицировано не менее 50% здоровых мужчин и женщин в возрасте 30—50 лет, причем до 30% женщин являются носителями одновременно обеих микоплазм. Существует мнение, что уреаплазменная инфекция (уреаплазмоз) может быть причиной бесплодия, женского — вследствие воспалительных процессов гениталий; и мужского — в результате воздействия на сперматогенез и сперматозоиды (уреаплазмы адсорбируются на сперматозоидах, нарушают их подвижность и изменяют форму). Кроме того, M.hominis при внутриутробном заражении плода может быть причиной врожденных аномалий развития ребенка в связи с ее способностью воздействовать на хромосомы клетки. M.hominis обычно имеет форму коротких нитей длиной 2-5мкм, иногда до З0 мкм, не обладает протеолитической активностью, не восстанавливает ни тетразолия, ни метиленового синего ни в аэробных, ни в анаэробных условиях. В качестве источника энергии использует аргинин; глюкозу и маннозу не ферментирует. На плотных средах с дрожжевым экстрактом и лошадиной сывороткой образует характерные колонии типа «глазуньи», обладает гемолитическим действием, которое связано с продукцией Н2О2. M.hominis высокорезистентны к эритромицину (минимальная бактериостатическая концентрация 500-1000мкг/мл и выше). В антигенном отношении гетерогенны: различают 8 серотипов. В организме человека чаще всего паразитирует на слизистой оболочке нижних отделов мочеполовых путей (уретра, влагалище, шейка матки), реже — на слизистой оболочке зева и глотки. Ureaplasma urealyticum. Первоначально в связи с очень маленькими колониями, которые они образуют (15—З0 мкм в диаметре), были названы как Т-группа микоплазм (от англ. tiny — мельчайшие). Но поскольку они отличаются от всех других видов микоплазм своей способностью гидролизовать мочевину, впоследствии были выделены в самостоятельный род Ureaplasma, представленный пока единственным видом U.urealyticum. Их морфология, ультраструктура и способ размножения такие же как и у других микоплазм. Очевидно, мочевина, в дополнение к холестерину, является жизненно важным питательным веществом для этого вида микоплазм. Ее гидролиз сопровождается выделением аммиака. Глюкозу, маннозу и аргинин не потребляют, тетрозолия не восстанавливают, обладают протеолитической и фосфатазной активностью и вызывают гемолиз эритроцитов морской свинки. Высокочувствительны к эритромицину — минимальная ингибирующая доза 0,8-3,0мкг/мл. На плотных средах образуют очень мелкие колонии, но на некоторых средах — и более крупные, диаметром до 175-2ООмкм. Хотя они обычно грубо гранулярные и не имеют или имеют едва заметный центральный бугорок, на соответствующих средах становятся гладкими и приобретают типичный вид «глазуньи». Температурный оптимум для роста 35-37 °С, оптимальная рН 6,0—6,5. Колонии на плотных средах, как правило, не адсорбируют эритроцитов человека и морской свинки. В антигенном отношении неоднородны: различают 8 серотипов штаммов человеческого происхождения и 8 серотипов животного происхождения. U.urealyticum обычно паразитирует на мембранах слизистой оболочки мочеполовой системы человека, а также крупного рогатого скота, собак и обезьян, иногда на слизистой оболочке зева и глотки человека и на слизистой оболочке зева и конъюнктиве крупного рогатого скота. Роль M.genitalium в этиологии урогенитальных микоплазмозов требует выяснения. Эпидемиология. Источник инфекции — инфицированный человек, в том числе, и очень часто, бессимптомный носитель микоплазм. Заражение происходит главным образом путем полового контакта. У инфицированных беременных женщин возможно внутриутробное заражение плода через околоплодные воды (возбудитель проникает восходящим путем из шейки матки), гематогенно или во время родов. При внутриутробном заражении поражаются органы дыхания, зрения, почки, печень, ЦНС, что может быть причиной гибели плода. Во время беременности уреаплазменная инфекция нередко активизируется и может также стать причиной преждевременных родов и спонтанных абортов. ^ играет решающую роль в распознавании урогенитальных микоплазмозов. Это тем более важно, что среди людей широко распространено бессимптомное носительство этих условно-патогенных микроорганизмов. Используются главным образом бактериологический и серологический методы. Материалом для выделения возбудителей служат слизь из уретры и влагалища, секрет простаты, сперма, моча. Посевы производят на селективные для микоплазм питательные среды, а для роста U.urealyticum — обязательно с мочевиной. Выделенные культуры идентифицируют по морфологическим, культуральным и иным признакам. Кроме того, для их типирования используют реакции угнетения роста или метаболизма специфическими иммунными сыворотками. Для обнаружения микоплазм или их антигенов используют непрямую иммунофлуоресценцию, РПГА с антительным диагностикумом, ИФМ, реакции преципитации, РАГА. Для серологической диагностики также могут быть использованы ИФМ, РПГА, РАГА. Однако серологическая диагностика недостаточно надежна, так как нет четкой зависимости между титром специфических антител и присутствием возбудителя. Лечение. Если возбудителем острой инфекции является U.urealyticum, наиболее эффективно применение эритромицина, в случае M.hominis — тетрациклинов. Профилактика урогенитальной инфекции должна быть такой же, как и других венерических заболеваний. Целесообразна организация диспансерного учета больных и носителей микоплазм в группах повышенного риска (проститутки, гомосексуалисты). Особого внимания требуют женщины детородного возраста, которые страдают хроническими урогенитальными заболеваниями неясной этиологии, для предупреждения внутриутробного микоплазмоза. ^ Ревматоидным артритом болеют около 1-2,5% населения Европы и Америки, и приблизительно у 60~80% таких больных обнаруживаются различные виды микоплазм или их антигены. Это обстоятельство, а также воспроизведение заболевания, сходного с ревматоидным артритом, при экспериментальном заражении животных дает основание рассматривать микоплазмы как возможных возбудителей ревматоидного артрита. Однако многие вопросы, касающиеся этиологии, способа заражения и механизма патогенеза ревматоидного артрита, требуют изучения. Из синовиальной жидкости и ткани суставов при ревматоидном артрите выделяют M.arthritidis, M.fermentans, M.pneumoniae и U.urealyticum. Отличительной особенностью M.arthritidis является также то, что они способны разжижать желатин, но не свертывают сыворотку, не гидролизуют казеин. Данных о способности их колоний адсорбировать эритроциты опубликовано не было. Гемолизин идентифицирован как Н2О2. Источником возбудителя ревматоидного артрита является больной человек или бессимптомный носитель микоплазм. ^ основана на выделении возбудителя из синовиальной жидкости, ткани суставных хрящей и последующей его идентификации или на обнаружении возбудителя (его антигенов) в исследуемых биосубстратах и в сыворотке крови (в том числе в составе циркулирующих иммунных комплексов) с помощью иммунофлуоресценции, РСК, РПГА, РАГА и ИФМ. Для диагностики заболеваний, вызываемых микоплазмами, созданы высокоспецифические ДНК-зонды, которые позволяют не только обнаружить наличие микоплазм в исследуемом материале, но и установить их видовую принадлежность. Занятие № 12. Тема занятия: «Методы диагностики вирусных инфекций». ^
Студент должен знать:
Студент должен уметь:
^
^
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ И ИНФОРМАЦТОННЫЙ МАТЕРИАЛ: Для диагностики вирусных заболеваний применяют следующие методы:
При вирусоскопическом методе в исследуемом материале обнаруживают с помощью электронной микроскопии вирионы или с помощью светооптической микроскопии — внутриклеточные включения. Метод электронной микроскопии дает возможность обнаружить вирионы, но он недостаточно специфичен. Гораздо более специфичным, чувствительным и надежным является метод иммунной электронной микроскопии. Он оказался особенно ценным в обнаружении тех вирусов, которые не размножаются в культуре клеток и для которых нет других тест-систем. В основе этого метода лежит взаимодействие антител с вирусами при смешивании вируссодержащего материала со специфической сывороткой. В результате взаимодействия антител с вирусами образуются микропреципитаты, состоящие из вирусных частиц, покрытых своеобразным «венчиком». Специфичность агрегации вирионов антителами позволяет надежно их идентифицировать. Разрешающая способность метода возрастает благодаря тому, что образование иммунных агрегатов повышает концентрацию вирионов в микропрепарате. Сам процесс иммунной электронной микроскопии включает следующие процедуры:
Единственный недостаток этого метода заключается в его громоздкости, поэтому он не может быть использован для массовых исследований. ^ основан на выделении вирусов и их идентификации с использованием культур клеток или куриных эмбрионов. Для проведения вирусологического исследования важное значение имеют: выбор материала и его предварительная обработка, условия транспортировки и соблюдение необходимых условий для культивирования вируса. Материал для исследования определяется характером вирусного заболевания, местом размножения вируса в организме и путями его выделения. В соответствующих главах указано, при каких заболеваниях какой материал необходимо брать для выделения вируса. Для подавления возможного роста бактерий исследуемый материал обрабатывают антибиотиками, или последние добавляют в питательную среду для выращивания культуры клеток в соответствующих концентрациях. Выбор способа культивирования (заражение лабораторных животных, куриных эмбрионов или культур клеток) определяется биологией предполагаемого возбудителя. Важное значение имеет соблюдение стандартных условий культивирования: оптимальная температура, продолжительность, использование дополнительных тестов для индикации (бляшкообразование, реакции гемадсорбции, гемагглютинации, иммунофлуоресценции и т. д.). Для идентификации вирусов применяются типоспецифические сыворотки. ^ могут быть использованы для обнаружения в исследуемом материале как специфических антител, так и вирусных антигенов. Для этих целей могут быть использованы все известные серологические реакции:
Из перечисленных методов все большей популярностью пользуются методы иммуноферментного анализа, отличающиеся высокой специфичностью и удобством использования. ^ применяемый в прямом и обратном вариантах, является методом ускоренной диагностики. Биологический метод основан на использовании животных, чувствительных к соответствующему вирусу. ^ — один из наиболее перспективных способов исследования в современной биологии и медицине. Он может быть использован для выявления любых генов, любых фрагментов нуклеиновых кислот. В его основе лежит способность однонитевых молекул нуклеиновых кислот вступать во взаимодействие с комплементарными нитями и образовывать двунитевые гибридные молекулы. Гибридизация осуществляется или в растворах, или, чаще всего, на твердых подложках, таких, например, как нитроцеллюлозная мембрана. Исследуемую клеточную суспензию лизируют для высвобождения нуклеиновых кислот. После этого двухцепочечную ДНК предварительно денатурируют, а образующиеся одноцепочечные молекулы переносят на мембрану, где они ковалентно связываются с ДНК-зондом, который представляет собой меченные изотопом или ферментом денатурированные молекулы нуклеиновой кислоты. Гибридизация происходит лишь в том случае, если между зондом и иммобилизованной на мембране нитью ДНК имеется гомология. ^ (ЦПР) охарактеризован выше. Тестовые задания: Укажите правильные ответы:
а) в МПА б) в курином эмбрионе в) в среде 199 г) на тканевых культурах д) в лабораторных животных 2. Для идентификации вирусов используют а) цветную пробу б) реакцию торможения гемагглютинации в) реакцию нейтрализации цитопатического действия вирусов г) реакцию связывания комплемента д) реакцию пассивной гемагглютинации 3. Для индикации вирусов используют а) цветную пробу б) реакцию нейтрализации в) реакцию гемагглютинации г) реакцию торможения гемадсорбции 4. Для диагностики вирусных инфекций используют а) бактериологический метод б) вирусологический метод в) вирусоскопический метод г) микологический метод д) серологический метод 5. Какие компоненты участвуют в реакции торможения гемадсорбции? а) монослой клеток б) исследуемый материал с вирусом в) эритроциты г) бактерии д) диагностическая противовирусная сыворотка е) диагностическая антибактериальная сыворотка 6. Какие препараты используют для специфической профилактики вирусных инфекций? а) антибиотики б) вакцины в) γ-глобулины г) витамины 7. Каким действием обладает интерферон? а) противоопухолевым б) противовирусным в) противопротозойным г) иммуностимулирующим д) антибактериальным Занятие № 13. Тема занятия: «Лабораторная диагностика вирусных респираторных инфекций (грипп, прагрипп, корь, эпидемический паратит). ^
Студент должен знать:
Студент должен уметь:
^
^ 1. Указать правильные ответы в тестовых заданиях. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ И ИНФОРМАЦИОННЫЙ МАТЕРИАЛ: Вирусы — возбудители острых респираторных заболеваний Возбудителями заболеваний дыхательных путей могут быть различные виды бактерий (в том числе Mycobacterium tuberculosis, Staphylococcus, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus, Klebsiella, Coxiella burnetii, Mycoplasma и др.), а также вирусы. Инфекции, вызываемые вирусами, принято называть острыми респираторными заболеваниями (ОРЗ). По своей частоте они занимают первое место среди всех заболеваний. Каждый человек в течение жизни неоднократно болеет ОРЗ. Причин этому несколько: большое количество вирусов — возбудителей ОРЗ (более 130); отсутствие перекрестного иммунитета между ними; отсутствие против многих из них эффективных вакцин; наипростейший способ заражения (воздушно-капельным путем), обусловливающий быстрое распространение возбудителя, которое при отсутствии иммунитета может стать причиной не только эпидемий, но и пандемий. Возбудителями ОРЗ являются следующие вирусы;
Все перечисленные пять семейств относятся к РНК-содержащим вирусам. 6. Респираторные аденовирусы (Adenoviridae), их геном представлен ДНК. Таким образом, возбудителями ОРЗ являются 5 семейств РНК-содержащих и 1 семейство ДНК-содержащих вирусов. Возникает вопрос: почему столь большое количество разнообразных вирусов может поражать эпителиальные клетки слизистой оболочки дыхательных путей (главным образом верхних) и глаза? Ответ на этот вопрос может быть однозначным: мембраны этих клеток несут множество разнообразных рецепторов, с которыми взаимодействуют разнообразные рецепторы вирусов. Только после специфической адсорбции на клетке вирус может в нее проникнуть и вызвать заболевание. По частоте, с которой они вызывают ОРЗ, вирусы можно расположить в следующей последовательности в порядке убывания: риновирусы, коронавирусы, RS-вирус, вирусы парагриппа, аденовирусы, вирус гриппа. Однако по масштабу вызываемых вспышек и по тому ущербу, который они наносят здоровью человека и экономике, главную роль играют вирусы гриппа. ^ Вирус гриппа А вызвал крупнейшие пандемии в 1889, 1918 («испанка»), 1957, 1968, 1977 гг. Название болезни «грипп» было дано в XVIII в. французским врачом Ф. Бруссе (от фр. gripper — схватить). В Италии эта болезнь получила название «инфлюэнца» (итал. influenza di freddo — влияние холода). Грипп вызывают три вируса: А (открыт в 1933 г. В. Смитом, С. Эндрюсом и П. Лейдлоу), В (открыт в 1940 г. Т. Френсисом) и С (открыт в 1947 г. Р. Тэйлором). Отличаются типы вируса А, В и С по нуклеопротеидным антигенам. Вирус типа А вызывает грипп у человека, млекопитающих животных и птиц, а вирусы типа В и типа С — только у человека. Наибольшую роль в эпидемиологии гриппа играет вирус типа А, он вызывал все пандемии, что связано с особой изменчивостью его антигенной структуры. Начиная с 1957 г., эпидемии гриппа происходят ежегодно. Вирус гриппа А Вирион имеет сферическую форму и диаметр 80-120 нм, его молекулярная масса 250 МД. Геном вируса представлен однонитевой фрагментированной (8 фрагментов) негативной РНК с общей м.м. 5 МД. Тип симметрии нуклеокапсида спиральный. Вирион имеет суперкапсид (мембрану), содержащий два гликопротеида — гемагглютинин и нейраминидазу, которые выступают над мембраной в виде различных шипов. Гемагглютинин имеет структуру тримера с м.м. 225 кД; м.м. каждого мономера 75 кД. Мономер состоит из меньшей субъединицы с м.м. 25 кД (НА2) и большей — с м.м. 50 кД (НА1). Основные функции гемагглютинина:
^ Вирус гриппа чувствителен к нагреванию (при 65 °С погибает в течение 5-10 мин), высушиванию, действию солнечных лучей, УФ-свету; при комнатной температуре погибает за несколько часов. Легко обезвреживается дезинфицирующими веществами, разрушается эфиром, который растворяет его липидную оболочку, а также кислой и щелочной средой. Эпидемиология. Источник инфекции — только человек, больной или носитель (у некоторых людей грипп протекает в стертой или даже скрытой форме). Заражение происходит воздушно-капельным путем. В связи с тем, что инкубационный период очень короток, возникшая эпидемия распространяется очень быстро и при отсутствии коллективного иммунитета может перерасти в пандемию. Основным регулятором эпидемий гриппа является иммунитет. По мере нарастания иммунной прослойки к вирусу эпидемия гриппа идет на убыль. Но, вместе с тем, в результате формирования иммунитета происходит селективный отбор штаммов вируса с измененной антигенной структурой, прежде всего гемагглютинина и, в меньшей степени, нейраминидазы, которые продолжают вызывать вспышки до тех пор, пока и к ним не появятся антитела. Такой антигенный дрейф и поддерживает непрерывность эпидемий. Однако у вируса гриппа А обнаружена еще одна форма изменчивости, получившая название шифта, или сдвига, связанная с полной сменой одного типа гемагглютинина (а реже и нейраминидазы) на другой. Все пандемии гриппа были вызваны вирусами гриппа А, претерпевшими шифт. Пандемия гриппа 1918 г. была вызвана вирусом с фенотипом H1N1 (погибло около 20 млн человек); пандемия 1957 г. — вирусом H2N2 (переболело более половины населения мира); 1968 г. — вирусом H3N2. Для объяснения причин такой резкой смены типов вирусов гриппа А были предложены две гипотезы. Согласно одной из них, вирус, вызвавший пандемию, после возникновения к нему иммунитета переходит на популяции млекопитающих или птиц. Затем в результате генетических рекомбинаций (чему способствует фрагментированный геном) между вирусами А человека и животных возникает рекомбинантный штамм с новым типом гемагглютинина, к которому у людей еще нет иммунитета, и он вызывает новую пандемию гриппа. Согласно другой, антропонозной гипотезе, выдвинутой А. А. Смородинцевым, вирус, исчерпавший свои эпидемические возможности, не исчезает, а продолжает циркулировать в коллективе без заметных вспышек или длительно персистировать в организме человека. Через 10-20 лет, когда появится новое поколение людей, не имеющих к нему иммунитета, этот вирус возвращается и становится причиной новой пандемии. В пользу этой гипотезы говорит тот факт, что вирус гриппа А с фенотипом H1N1, исчезнувший в 1957 г., когда его вытеснил вирус H2N2, вновь появился, после двадцатилетнего отсутствия, в 1977 г. Кроме того, по данным серологической археологии, пандемия 1889 г. была, очевидно, вызвана вирусом с фенотипом H2N2, так как в 1957 г. антитела к нему были обнаружены только у людей старше 70 лет, не болевших во время пандемии 1957 г. Наконец, установлено, что грипп у людей вызывали и вызывают вирусы типа А только трех или четырех фенотипов, а именно; H1N1 (H0N1); H2N2; H3N2. Вместе с тем выявилась новая эпидемиологическая особенность гриппа: если раньше каждый новый пандемический вариант полностью вытеснял своего предшественника, то с 1977 г. вирусы с фенотипами H1N1 и H3N2 как бы сосуществуют в коллективе, обладая, вероятно, до определенного времени равными эпидемическими возможностями. Антигенные дрейфы и шифты вируса гриппа являются главным препятствием на пути к созданию эффективных вакцин. ^ Инкубационный период при гриппе короткий — 1-2 сут. Вирус размножается в эпителиальных клетках слизистой оболочки дыхательных путей с преимущественной локализацией в области трахеи, что клинически проявляется в виде сухого мучительного кашля с болями по ходу трахеи. Продукты распада пораженных клеток попадают в кровь, вызывают сильную интоксикацию и повышение температуры тела до 38-39 °С. Повышение проницаемости сосудов, обусловленное повреждением клеток эндотелия, может стать причиной патологических изменений в различных органах: точечных кровоизлияний в трахее, бронхах, а иногда и отека мозга с летальным исходом. Вирус гриппа оказывает угнетающее действие на кроветворение и иммунную систему. Все это может приводить к вторичным вирусным и бактериальным инфекциям, которые осложняют течение болезни. ^ Прежние представления о том, что после перенесенного гриппа остается слабый и кратковременный иммунитет, опровергнуты после возвращения вируса H1N1 в 1977 г. Этот вирус вызывал заболевание главным образом у людей не старше 20 лет, т. е. у тех, кто не болел им раньше, до 1957 г. Следовательно, постинфекционный иммунитет достаточно напряженный и продолжительный, но носит выраженный типоспецифический характер. Главная роль в формировании приобретенного иммунитета принадлежит вируснейтрализующим антителам, блокирующим гемагглютинин и нейраминидазу, а также секреторным иммуноглобулинам IgAs. ^ Материалом для исследования служит отделяемое носоглотки, которое получают либо путем смыва, либо с помощью ватно-марлевых тампонов, и кровь. Методы диагностики:
Лечение. Рекомендуются химиопрепараты: амантадин и ремантадин (действуют только на вирус гриппа А), противогриппозный иммуноглобулин, интерферон. Лечение следует начинать как можно раньше. ^ Ежегодно в мире гриппом болеют сотни миллионов людей, что наносит колоссальный ущерб здоровью населения и экономике каждой страны. Единственным надежным средством борьбы с ним является создание коллективного иммунитета. Для этой цели предложены и используются следующие типы вакцин:
Детей от 6 мес до 12 лет, по рекомендации ВОЗ, следует прививать только субъединичной вакциной как наименее реактогенной и токсичной. Главная проблема в повышении эффективности противогриппозных вакцин — обеспечение их специфичности против актуального вируса, т. е. того варианта вируса, который вызвал данную эпидемию. Иначе говоря, вакцина должна содержать специфические антигены актуального вируса. Основным путем повышения качества вакцины является поиск тех эпитопов вирусов гриппа, которые являются наиболее консервативными, а стало быть, общими для всех его антигенных вариантов, и придают им высокую иммуногенность. По этому пути ведутся поиски высокоэффективных искусственных вакцин против гриппа. Вирус гриппа В Структура вириона сходна со структурой вируса А. Геном состоит из 8 фрагментов, кодирующих 3 неструктурных и 7 структурных белков. По антигенным свойствам гемагглютинина и нейраминидазы различают несколько серовариантов. Процесс антигенного дрейфа выражен слабее, чем у вируса А. Вирусы гриппа типа В являются виновниками локальных вспышек и эпидемий; пандемий не вызывают. Клиника заболевания такая же, как и при гриппе типа А. Лабораторная диагностика такая же, вирус дифференцируется серологически. Специфическая профилактика осуществляется так же, как против гриппа А. Вирус гриппа С Вирион имеет такую же форму, как вирусы типов А и В. Однако он отличается от них не только антигенными свойствами, но и по ряду других признаков. Геном представлен однонитевой негативной РНК из 7 фрагментов, нуклеотидная последовательность которых существенно отличается от таковых вирусов типов А и В. Геном кодирует 1-2 неструктурных и 6 структурных белков. У вируса типа С отсутствует нейраминидаза, поэтому на наружной мембране вириона имеется только один тип шипов, имеющих такие же размеры, как и у вирусов типов А и В (высота 8-10 нм, диаметр 4-5 нм), но расположенных, в отличие от вирусов А и В, не беспорядочно, а с четкой гексагональной ориентацией на расстоянии 7,5 нм друг от друга. Вирусу типа С не свойственна такая изменчивость, как вирусу типа А. Хотя вирус гриппа С не вызывает пандемий и больших эпидемий, он часто является причиной спорадических заболеваний гриппом. Клиника заболевания такая же, как при относительно умеренных формах гриппа А. Диагностика основана на выделении вируса в куриных эмбрионах; применяются также иммунофлуоресцентный метод и другие серологические реакции. Парамиксовирусы Вирусы парагриппа человека (ВПГЧ) впервые выделены в 1956—1958 гг. в США из носоглотки у детей, больных гриппоподобными заболеваниями, в связи с чем и получили такое название. Вирионы имеют сферическую форму, их диаметр 150-200 нм. Вирусы парагриппа обладают гемагглютинирующей, нейраминидазной, гемолитической и симпластообразующей активностью, однако у разных типов вирусов они проявляются в разной степени. Особенностью размножения вирусов парагриппа, как и всех парамиксовирусов, является то, что, в отличие от вирусов гриппа, они не нуждаются для своей транскрипции в затравочной мРНК и поэтому не проникают в ядро клетки. Их жизненный цикл, подобно вирусу леса Семлики, протекает в цитоплазме клетки. ВПГЧ плохо размножаются в куриных эмбрионах. Для их выделения применяют культуры клеток, в основном первично-трипсинизированных, при размножении в которых они легко могут быть обнаружены с помощью реакции гемадсорбции. Парамиксовирусы не имеют общего антигена, единого для всего семейства. ВПГЧ по поверхностным антигенам разделены на четыре сероварианта, но их внутренние белки имеют общие детерминанты. Вирусы парагриппа — очень распространенные возбудители ОРЗ. У взрослых эти заболевания протекают легче, чем грипп. При этом ВПГЧ чаще поражают клетки гортани, поэтому заболевание протекает с явлениями ларингита (сухой болезненный кашель, охрипший голос). У детей заболевания, вызываемые ВПГЧ, протекают более тяжело, у них чаще развивается интоксикация. Наиболее тяжело протекают заболевания, вызываемые ВПГЧ-3, особенно у детей первого года жизни. ВПГЧ-3 являются виновником 60-70% заболеваний нижних отделов дыхательных путей (бронхиолиты, пневмонии) у детей первых полутора лет жизни. Для заболеваний, вызываемых вирусами парагриппа 1-го и 2-го типов, характерен симптом ложного крупа. Вирусы парагриппа вызывают в основном локальные вспышки, однако они наблюдаются повсеместно, особенно в странах с умеренным климатом. ^ парагриппозных заболеваний применяются следующие методы: а) обнаружение вирусных антигенов с помощью методов иммунофлуоресценции и ИФМ в эпителиальных клетках слизистой оболочки носовых ходов и носоглотки; б) выделение вируса в культурах клеток с последующей идентификацией его с помощью реакций торможения гемадсорбции или гемагглютинации; в) определение противовирусных антител с помощью реакций торможения гемадсорбции (гемагглютинации) или нейтрализации в культуре клеток с использованием парных сывороток (нарастание титра антител). Методы специфической профилактики не разработаны. ^ Эпидемический паротит — острое вирусное заболевание, для которого характерным является поражение одной или обеих околоушных слюнных желез. Возбудитель был выделен в 1934 г. К. Джонсоном и Р. Гудпасчуром из слюны больного свинкой путем заражения обезьян в проток слюнной железы. Морфологически вирус сходен с другими парамиксовирусами, обладает гемагглютинирующей, гемолитической, нейраминидазной и симпластообразующей активностью. Антигенная структура вируса стабильна, никаких серовариантов не описано. Вирус малоустойчив, разрушается в течение нескольких минут при воздействии жирорастворителей, детергентов, 2% фенола, 1% лизола и других дезинфицирующих веществ. Лабораторные животные к вирусу паротита малочувствительны. Лишь у обезьян путем введения им вируса в проток слюнной железы удается воспроизвести сходное с паротитом человека заболевание. ^ Заболевание встречается повсеместно. Источником инфекции является только больной человек (в том числе с бессимптомной формой болезни). Он заразен в течение всего инкубационного периода и первой недели болезни. Болеют дети 5-15 лет (чаще мальчики), однако могут болеть и взрослые. ^ Инкубационный период составляет в среднем 14-21 день. Вирус проникает из полости рта по стенонову протоку в околоушную слюнную железу, где и происходит в основном его размножение. Возможно, что первичное размножение вируса происходит в эпителиальных клетках верхних дыхательных путей. Поступая в кровь, вирус может проникнуть в различные органы (яички, яичники, поджелудочную и щитовидную железы, мозг) и вызвать соответствующие осложнения (орхит, менингит, менингоэнцефалит, реже — тиреоидит, полиартрит, нефрит, панкреатит; тяжелые формы орхита могут обусловить последующую половую стерильность). Наиболее типичным проявлением болезни является воспаление и увеличение околоушных и других слюнных желез, сопровождающееся умеренным повышением температуры. Как правило, в неосложненных случаях заболевание заканчивается полным выздоровлением. Очень часто оно протекает бессимптомно. ^ прочный, длительный, повторных заболеваний почти не бывает. Естественный пассивный иммунитет сохраняется в течение первых шести месяцев жизни ребенка. ^ Применяют вирусологические и серологические методы, используя слюну, мочу, спинномозговую жидкость, пунктат желез. Заражают 7-8-дневные куриные эмбрионы или культуры клеток. Вирус идентифицируют с помощью реакций торможения гемагглютинации (гемадсорбции), иммунофлуоресценции, нейтрализации и связывания комплемента. Серологическая диагностика осуществляется на основании нарастания титра антител в парных сыворотках больных с помощью РТГА или РСК. ^ По мнению Международной службы по ликвидации заболеваний, эпидемический паротит относится к группе потенциально ликвидируемых болезней. Основным средством для ее ликвидации является создание коллективного иммунитета с помощью живой вакцины, приготовленной из аттенуированного штамма (пассажи на куриных эмбрионах приводят к снижению патогенности вируса для человека). Вакцина вводится подкожно однократно детям на первом году жизни, иммунитет столь же стойкий, как и постинфекционный. К категории потенциально ликвидируемых болезней относятся также краснуха и корь. Поэтому для ликвидации их рекомендуется применение трехвалентной вакцины (против кори, краснухи и паротита). ^ Корь (лат. morbilli) — острое вирусное заболевание преимущественно детского возраста, характеризующееся общей интоксикацией, повышением температуры, катарами слизистых оболочек дыхательных путей и макуло-папулезной сыпью. ^ был выделен в 1954 г. Дж. Эндерсом и Т. Пиблесом. Морфологически он сходен с другими парамиксовирусами: диаметр вириона 150-250 нм. Гемагглютинин, гемолизин (F), нуклеопротеид (NP) и матриксный белок различаются по антигенной специфичности и степени иммуногенности. Наибольшей иммуногенностью обладает гемагглютинин. С помощью моноклональных антител обнаружено несколько серовариантов вируса кори человека. Он имеет также общие антигенные детерминанты с вирусами чумы собак и чумы рогатого скота. Лабораторные животные к вирусу кори маловосприимчивы. Только у обезьян вирус вызывает болезнь с характерными клиническими симптомами, причем в естественных условиях обезьяны могут заражаться от людей. В куриных эмбрионах вирус кори размножается плохо. Для его выделения используют первично-трипсинизированные культуры клеток почек обезьян или эмбрионов человека, в которых вирус при размножении вызывает характерный цитопатический эффект (образование гигантских многоядерных клеток — симпластов и синцитиев — и зернистых включений в цитоплазме и ядре). Однако вирус кори может быть адаптирован и к клеточным культурам из почки собак, телят или к клеткам амниона человека, а также к различным перевиваемым линиям. Вирус может оказывать мутагенное действие на хромосомы клеток. Вирус нестоек, быстро инактивируется в кислой среде, снижает свою активность при 37 °С, при 56 °С погибает через 30 мин, легко разрушается жирорастворителями, детергентами, очень чувствителен к солнечному свету и во внешней среде быстро погибает. Устойчив к низкой температуре (-70 °С). Эти обстоятельства следует учитывать при транспортировке и хранении живой противокоревой вакцины. ^ Источником инфекции является только больной человек. Он становится заразным с последнего дня инкубационного периода и до 4-5-го дня после появления сыпи. ^ Заражение происходит воздушно-капельным путем. Вирус размножается в эпителиальных клетках слизистой оболочки носоглотки, трахеи и бронхов. Проникая в кровь, вызывает поражение клеток эндотелия сосудов, вследствие чего появляется сыпь. Наиболее характерным симптомом является образование на слизистой оболочке щек пятен Коплика-Филатова. Инкубационный период около 10 дней. Картина болезни настолько характерна, что диагноз легко ставится клинически. В продромальном периоде — явления ОРЗ (ринит, фарингит, конъюнктивит). Дифференциальное диагностическое значение имеет появление пятен Коплика—Филатова. Сыпь папулезного характера появляется обычно на четвертый день после повышения температуры, сначала на голове (лоб, за ушами), а затем распространяется по всему телу. Температура тела нормализуется к 7-8-му дню. Наиболее частое осложнение — пневмония, а в раннем периоде заболевания — отек гортани, круп. Очень редко корь протекает в необычной, тяжелой форме — в виде острого коревого энцефалита, чаще у детей старше 8-10-летнего возраста. У детей, получавших с профилактической целью противокоревой иммуноглобулин, болезнь протекает в легкой форме (митигированная корь). Постинфекционный иммунитет прочный, пожизненный, обусловлен вируснейтрализующими антителами, Т-цитотоксическими лимфоцитами и клетками иммунной памяти. ^ проводится в случае необходимости. Методом быстрой диагностики является обнаружение специфического вирусного антигена в пораженных клетках с помощью иммунофлуоресценции. Для выделения вируса заражают исследуемым материалом (слизь из носоглотки, кровь в период до первых суток появления сыпи) культуры клеток. О размножении вируса судят, по характерному цитопатическому эффекту и положительной реакции гемагглютинации. Идентифицируют вирус с помощью РИФ, РТГА и РН в культурах клеток. Для серологической диагностики используют РСК, РТГА и РН в культуре клеток. ^ Ранее широко применялась серопрофилактика. С этой целью детям, контактировавшим с больным, вводили иммуноглобулин. Однако он оказывается эффективным только в том случае, если его вводят не позднее 7-го дня инкубационного периода. В настоящее время в основу борьбы с корью, которая также относится к группе потенциально ликвидируемых заболеваний, положена массовая вакцинация детей. С этой целью применяют живые вакцины из аттенуированных штаммов (в России — из штамма Л-16). Вакцинацию проводят однократно, подкожно на первом году жизни. Основным условием поддержания эффективности вакцины является строгое соблюдение температурного режима ее транспортировки и хранения. ^ Укажите правильные ответы:
а) коронавирусов б) аденовирусов в) парамиксовирусов г) ортомиксовирусов 2. Вирус кори по строению а) простой вирус б) сложный вирус в) имеет суперкапсид г) не имеет суперкапсид д) имеет нуклеокапсид 3. Для специфической профилактики эпидемического паротита используют: а) АКДС б) БЦЖ в) живую вакцину, полученную Смородинцевым А.А. и сотр. г) ремантадин 4. Вирус птичьего гриппа относится а) к вирусу гриппа типа С б) к вирусу гриппа типа А в) к вирусу гриппа типа В г) к вирусу гриппа типа Д 5. Какой тип нуклеиновой кислоты содержит вирус ветряной оспы? а) РНК б) ДНК в) ДНК и РНК г) не содержит нуклеиновую кислоту 6. Для вируса натуральной оспы характерно: а) РНК-содержащий вирус б) ДНК-содержащий вирус в) простой вирус г) сложный вирус д) содержит гемагглютинин е) не содержит гемагглютинин 7. Для диагностики натуральной оспы используют: а) обнаружение телец Гварниери в цитоплазме пораженных клеток б) обнаружение телец Бабеша-Негри в пораженных клетках в) РТГА г) РСК д) реакцию преципитации 8. Вирусы парагриппа относят: а) к роду Paramyxavirus б) к роду Lyssavirus в) к роду Pneumovirus г) к роду Morbillivirus Занятие 14. |
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям