Приказ Минздрава России от 09. 01. 1998г. №2 инструкция по предупреждению несовместимости при переливании крови I. Введение > 1
|
|
Скачать 2.36 Mb.
|
|
c или e подбор следует вести из числа резус-положительных доноров. При этом обычно удается довольно быстро найти с-отрицательную еровь (16%), но значительно труднее е-отрицательную ввиду редкой встречаемости лиц, не содержащих этого фактора (2,5%). Большая или меньшая трудность подбора крови при антителах другой специфичности будет зависеть также от частоты факторов, к которым направлены антитела. Особенно затруднен подбор бывает при наличии антител к фактору Челлано, выявленному у 99,85% лиц, а также в случае сочетания антител разной специфичности. После такого индивидуального подбора кровь, заготовленная от доноров, передается в лечебное учреждение для переливания данному больному. в) индивидуальный подбор крови донора следует проводить также в тех случаях, когда у больного выявлены изоиммунные антитела, но не установлена их спцифичность. Это может быть связано с ограниченностью на СПК (ОПК) образцов стандартных эритроцитов, типированных по изосерологическим системам, а также, возможно, с наличием в крови больного антител к неизвестному до этого времени антигену. Подбор в таких случаях следует проводить, используя кровь из флакончиков-спутников или кровь, полученную непосредственно у донора из пальца, начиная его той же реакцие, с помощью которой оказались активными антитела больного. В таких случаях решить заранее вопрос, среди каких доноров легче подобрать кровь, бывает трудно. После такого индивидуального подбора кровь передается в лечебное учреждение для переливания данному больному. 8. ^ Как специальный, так и индивидуальный подбор крови, производимой на СПК (ОПК), является предварительной процедурой. Врач-трансфузиолог, получив флакон с кровью, должен во избежание ошибки сверить паспортные данные на флаконе с данными о крови больного в истории болезни, произвести контрольные реакции - определение группы крови больного и донора и пробы на совместимость. При совпадении группы крови и резус-принадлежности больного и донора и отсутствии агглютинации в пробах на совместимость, врач может приступить к переливанию крови, начав его с биологической пробы. 9. ^ У больных, перенесших гемотрансфузионное осложнение, происходят характерные серологические сдвиги, заключающиеся в том, что в период до 10-20-го дня идет нарастание сенсибилизации, выражающееся в повышении титра антител, послуживших причиной осложнения, и в появлении антител другой специфичности. После 20-го дня начинается постепенное снижение титра антител и исчезновение их в порядке, обратном появлению. Поэтому таким больным в период нарастания сенсибилизации, пробу на совместимость следует проводить с сывороткой, полученной от них непосредственно в день проведения трансфузии крови или не далее чем накануне. При переливании крови после 20-го дня, кроме этой пробы, желательно дополнительно проводить пробу на совместимость с порцией сыворотки, заготовленной на высоте сенсибилизации (10-20 день). Это дает возможность предупредить переливание больному крови, содержащей антиген, против которого у него совсем недавно имелись антитела. ^ Врач, переливающий кровь, обязан записать в историю болезни: 1) паспортные данные с каждого контейнера с кровью - фамилию и инициалы донора, группу крови, резус-принадлежность, номер контейнера и дату заготовки крови; 2) результат контрольной проверки групповой принадлежности крови больного; 3) результат контрольной проверки групповой принадлежности крови донора, взятой из контейнера; 4) результат пробы на совместимость по группам крови АВО; 5) метод и результат пробы на совместимость по резус-антигену D. Записи скрепляются подписью врача. ^ Самыми важными показателями, позволяющими судить о совместимости переливаемой крови (эритроцитов) являются совместимость по группе крови системы АВО и совместимость по резус-антигену D. Для обеспечения совместимости переливаемой крови необходимо на основании определения группы крови реципиента и записи в историю болезни, а также документации на контейнере с кровью, правильно выбрать кровь в отношении групп крови системы АВО и резус-принадлежности (см. раздел I.п.п.6,7). Непосредственно перед переливание крови, независимо от проведенных ранее исследований и имеющихся записей, врач обязан снова проверить групповую принадлежность реципиента и крови донора (раздел I.9), сделать пробу на совместимость по группам крови АВО (раздел III) и одну из проб на совместимость по резус-антигену D (разделы IV, V, VI, VII). Врач должен предусмотреть возможную несовместимость по отношению к другим антигенам и принять меры для ее предупреждения. Если кровь (эритроциты) донора оказалась несовместимой с кровью реципиента в пробе на совместимость по группам АВО или в пробе на совместимость по резус-антигену D, на не должна быть ему перелита! Если кровь (эритроциты) донора оказалась совместимой с кровью реципиента в пробах на совместимость по группам крови АВО и резус-антигену D и нет указаний на несовместимость по отношению к другим антигенам - кровь (эритроциты) может быть перелита. Переливание начинается с биологической пробы. Ответственным за выполнение перечисленных требований и обеспечение совместимости при переливании крови является врач специалист, переливающий кровь. Приложение 2 УТВЕРЖДЕНО Приказ Минздрава России от 09.01.1998г. № 2 ^ Стандартными изогемагглютинирующими сыворотками являются сыворотки, приготовленные из крови людей и некоторых других жидкостей, содержащие групповые антитела (агглютинины). Сыворотки предназначаются для определения групповой принадлежности крови людей по системе АВО. Стандартные изогемагглютинирующие сыворотки представляют собой прозрачную жидкость, окрашенную в соответствии с групповой принадлежностью, и расфасованную в ампулы или флаконы. На этикетке указываются названия учреждения, изготовившего сыворотку, специфичность, титр агглютининов и срок годности. ^ Источниками для получения стандартных сывороток служат: а) Кровь, заготовленная без консерванта от донора, предварительно обследованного и содержащего в крови групповые антитела с титром, достаточным для изготовления стандартных сывороток; б) плазма, полученная при проведении плазмафереза или отделенная из донорской крови, по каким-либо причинам неиспользованная для лечебных целей и содержащая групповые антитела с титром, достаточным для изготовления стандартных сывороток; в) дополнительный источник - плевральный транссудат, асцитическая жидкость, если в них содержатся групповые антитела с титром, достаточным для изготовления стандартных сывороток. ^ К стандартной изогемагглютинирующей сыворотке предъявляются следующие требования: а) сыворотка должна быть специфичной, то есть содержать определенные групповые антитела - a (анти-А), b (анти-В) или оба антитела вместе, и не вызывать неспецифической агглютинации эритроцитов одноименной группы и группы 0(I). Сыворотка группы AB(IV), не содержащая групповых агглютининов, не должна вызывать агглютинации; б) должна быть активной, что выражается в наступлении первых признаков агглютинации со стандартными эритроцитами групп А1 и В течение первых 30 секунд и со стандартными эритроцитами группы А2 в течение первой минуты и титром агглютининов по отношению к эритроцитами групп А1 и В не ниже, чем 1:32 и группы А2 - не ниже, чем 1:16. в) не должна оказывать на эритроциты гемолизирующего действия; г) должна быть прозрачной. Допускается небольшая опалесценция, что не влияет на качество сыворотки; д) должна быть окрашена: группа A(II) - в светло-синий цвет, группа - в красный цвет B(III), группа AB(IV) - в желтый цвет. е) должна быть предохранена от инфицирования прибавлением консервирующих средств; ж) должна иметь точную паспортизацию, т.е. обозначение групповой принадлежности, титра, срока годности, номера серии и наименования учреждения, ее изготовившего. Все эти сведения должны быть обозначены на этикетке, наклеиваемой на флакон (ампулу) со стандартной сывороткой, а также внесены в "Журнал регистрации изготовленной стандартной сыворотки", в который записывают также сведения о дате изготовления сыворотки и результатах контрольных проверок ее качества. ^ 1. Предварительное определение пригодности крови донора для изготовления из нее стандартной изогемагглютинирующей сыворотки путем взятия от него крови и отделения от нее сыворотки или путем получения плазмы с помощью проведения плазмафереза. Исследования производятся заранее с пробной порции крови, полученной непосредственно от донора в небольшом количестве. 2. Взятие крови от донора, отделение от нее сыворотки или получение плазмы от донора при помощи плазмафереза. 3. Предварительное определение пригодности плазмы, предполагаемой для передачи в сывороточное отделение для изготовления из нее стандартной изогемагглютинирующей сыворотки. 4. Обработка плазмы для получения из нее сыворотки. 5. Сбор остатков крови из флакончиков (пробирок)-спутников в общую емкость, отделение от нее сыворотки (плазмы) и предварительное определение пригодности для изготовления стандартной изогемагглютинирующей сыворотки. 6. Получение в лечебных учреждениях асцитической жидкости, плеврального транссудата, освобождение их от сгустков фибрина и предварительное опеределение пригодности этого материала для изготовления из него стандартной изогемагглютинирующей сыворотки. 7. Определение пригодности сыворотки, плазмы для изготовления из нее стандартной изогемагглютинирующей сыворотки, включающее: а) определение групповой принадлежности сыворотки (групповых агглютининов); б) определение способности сыворотки вызывать неспецифическую агглютинацию; в) определение гемолизирующих свойств сыворотки; г) определение активности сыворотки; д) скорость наступления агглютинации; е) титр агглютининов. 8. Предварительное заключение о пригодности сыворотки. 9. Консервирование сыворотки. 10. Первый контроль сыворотки до розлива. 11. Второй контроль сыворотки до розлива. 12. Фильтрование сыворотки. 13. Окрашивание сыворотки. 14. Окончательное заключение о пригодности сыворотки. 15. Розлив сыворотки. 16. Паспортизация разлитой сыворотки. 17. Контроль разлитой сыворотки. ^ 1. Определение групповой принадлежности сыворотки при помощи стандартных эритроцитов. Определение производится на белой фарфоровой или любой другой белой пластинке со смачиваемой поверхностью, на которой надписывают обозначения: слева "О", в середине "А" и справа "В". Соответственно каждому обозначению на пластинку наносят по одной маленькой капле (0,01мл) стандартных эритроцитов групп 0(I), A(II), B(III). На каждую каплю эритроцитов капают одну большую каплю (0,1мл) испытуемой сыворотки с тем, чтобы соотношение количества эритроцитов и сыворотки было приблизительно 1:10. Эритроциты перемешивают с сывороткой сухой стеклянной палочкой, пластинку слегка покачивают, затем на 1-2 минуты оставляют в покое, потом снова покачивают и одновременно наблюдают результат. Наблюдение проводят в течение 5 минут. Через 3-5 минут в каждую каплю, в которой наступила агглютинация, добавляют 1 каплю (0,1мл) изотонического раствора NaCl и снова покачивают пластинку. Результат учитывают по наличию или отсутствию агглютинации в каждой капле. При этом возможны четыре варианта: - агглютинация наступила с эритроцитами групп A(II), и B(III), но отсутствует с эритроцитами группы 0(I). Это указывает на наличие в испытуемой сыворотке двух агглютининов a (анти-А) и b (анти-В), т.е. еа принадлежность испытуемой сыворотки к группе Оab(I); - агглютинация наступила с эритроцитами группы B(III) и отсутствует с эритроцитами групп О(I) и A(II). Это указывает на наличие в испытуемой сыворотке только агглютинина b(анти-В), т.е. на принадлежность испытуемой сыворотки к группе Аb(II); - агглютинация наступила с эритроцитами группы A(II) и отсутствует с эритроцитами групп O(I) и B(III). Это указывает на наличие в испытуемой сыворотке только агглютинина a (анти-А), т.е. на принадлежность испытуемой сыворотки к группе Вa(III); - агглютинация отсутствует с эритроцитами всех трех групп. Это указывает на отсутствие групповых агглютининов, т.е. на принадлежность испытуемой сыворотки к группе AB(IV). 2. ^ Эти исследования можно проводить одновременно с определением групповой принадлежности при помощи стандартных эритроцитов. Дополнительно в исследование включают 6-8 образцов эритроцитов группы О(I) и одногруппных с исследуемой сывороткой. Наблюдение результатов с эритроцитами одноименной группы и группы О(I) проводят 20 минут. Если испытуемая сыворотка вызывает агглютинацию эритроцитов одноименной группы и группы О(I), это значит, что она обладает свойством вызывать неспецифическую агглютинацию. В этих случаях учитывают скорость ее наступления и интенсивность. 3. ^ Гемолизирующие свойства сыворотки выявляются одновременно с определением групповой принадлежности при помощи стандартных эритроцитов. Если при смешивании с эритроцитами сыворотка вызывает ихгемолиз, значит сыворотка обладает гемолизирующими свойствами. 4. ^ Скорость наступления агглютинации определяют также, как групповую принадлежность - при помощи стандартных эритроцитов, но с дополнительным включением в реакцию стандартных эритроцитов группы А2. Скорость наступления агглютинации учитывают с помощью секундомера от момента перемешивания сыворотки с эритроцитами до момента наступления первых признаков агглютинации отдельно по отношению к эритроцитам групп А1, А2 и В. 5. ^ Для определения титра агглютининов в исследуемой сыворотке приготавливают разведения ее в изотоническом растворе NaCl. Для этого в штатив ставят 10 пробирок и в каждую из них вносят градуированной пипеткой по 1 мл изотонического раствора NaCl. Затем в первую пробирку той же пипеткой добавляют 1 мл испытуемой сыворотки и перемешивают ее с изотоническим раствором путем встряхивания пробирки. Из этой пробирки 1 мл смеси переносят во вторую и снова перемешивают и так до последней пробирки. В результате в пробирках образуются разведения сыворотки от 1:2 до 1:1024. Непосредственно на пластинке можно приготовить разведения сыворотки в арифметической прогрессии. Для этого следует сделать в пробирке первое исходное разведение (любое). Например, к одной капле сыворотки добавить 15 капель изотонического раствора хлорида натрия, получив таким образом разведение 1:16. Эту разведенную сыворотку нанести в 6 пронумерованных точек на пластинку: в первую точку добавить 2 капли, во вторую, третьб и все последующие - по 1 капле. Затем добавить изотонический раствор: во вторую точку - 1 каплю, в третью - 2 капли, в четвертую - 3 капли, в пятую - 4 капли, в шестую - 5 капель. Капли перемешивают стеклянной палочкой, начиная с последней точки в направлении кпервой. Так получают разведения сыворотки на пластинке: 1:16,1:32, 1:48, 1:64, 1:80, 1:96. При определении титра агглютинина a2 по отношению к эритроцитам А2 приготавливают дополнительно промежуточное разведение сыворотки 1:24. Разведения сыворотки можно приготовить, отмеряя сыворотку и изотонический раствор NaCl каплями, для чего используют одну и ту же пипетку. На пробирках отмечают степень разведения сыворотки. Далее 0,1 мл (одну большую каплю) каждого разведения сыворотки переносят на пластинку, предварительно надписав на ней обозначения степени разведения сыворотки: 1:2, 1:4 и т.д. до 1:1024. Разведения сыворотки можно приготавливать также непосредственно на пластинке. Для этого в десять пронумерованных точек наносят по одной большой капле (0,1 мл) изотонического раствора NaCl, в пераую точку добавляют одну каплю (0,1 мл) испытуемой сыворотки, перемешивают капли, затем той же пипеткой переносят одну каплю смеси во вторую точку и т.д. до десятой,получая такми образом разведения сыворотки от 1:2 до 1:1024. На пластинку рядом с каждой каплей разведенной сыворотки наносят маленьку каплю (0,01 мл) стандартных эритроцитов соответствующей группы, т.е. эритроциты А и А2, когда титруют агглютинины a и эритроциты группы В,когда титруют агглютинины b. Соотношение эритроцитов и сыворотки должно быть 1:10. Каждую каплю стандартных эритроцитов тщательно перемешивают с сывороткой сухой стеклянной палочкой, после чего пластинку покачивают, затем оставляют на 1-1,5 минуты в покое, снова покачивают и одновременно наблюдают результат в течение 5 минут. Наибольшее разведение сыворотки, в котором наступила агглютинация стандартных эритроцитов до истечения 5 минут, принимают за титр агглютининов в этой сыворотке. ^ Основным показателем пригодности крови донора для изготовления из нее стандартной сыворотки является ее активность, т.е. скорость наступления агглютинации и титр агглютининов. Скорость наступления агглютинации должна быть не более чем 30 секунд с эритроцитами групп А1 и В и не более 1 минуты с эритроцитами группы А2. Титр сыворотки должен быть: для агглютинина a не ниже, чем 1:32 по отношению к эритроцитам А1, не ниже 1:16 по отношению к эритроцитам А2 и для агглютинина b не ниже, чем 1:32 к эритроцитам В. При предварительном исследовании непосредственно взятой пробной порции крови титр агглютининов должен быть, хотя бы на одно разведение выше, в виду возможного его падения в процессе обработки и консервирования основной порции крови. Одновременно следует учитывать, не вызывает ли сыворотка крови неспецифической агглютинации или гемолиза эритроцитов. Если сыворотка вызывает слабую неспецифическую агглютинацию эритроцитов, позднее, чем через 2 минуты, то это не является противопоказанием к использованию этой крови, так как эти свойства при дальнейшей обработке сыворотки обычно исчезают. Если сыворотка вызывает неспецифическую агглютинацию ранее 2 минут, то брать у донора кровь для приготовления стандартной сыворотки не следует. Гемолизирующих свойств крови у доноров обычно не наблюдается, но если это имеет место, то брать кровь у донора не следует. В этом случае так же, как и при выраженной неспицифической реакции донора следует подвергнуть дополнительному медицинскому обследованию. Доноров, кровь которых соответствует требованиям, предъявляемым к стандартным сывороткам, следует брать на особый учет с целью дальнейшего использования их крови для изготовления стандартных сывороток. ^ Кровь у донора берут из вены в сухой стерильный сосуд. Через 15-30 минут сосуд с кровью встряхивают для отделения свертка от стенки и затем помещают на сутки в холодильник при температуре 4-8°С. Отделившуюся за это время сыворотку отсасывают или сливают в другой сосуд, а сосуд со свертком оставляют еще на одни сутки при 4-8°С. Обычно через одни сутки из свертка отделяется некоторое количество сыворотки, которую присоединяют к первой порции. Сыворотку консервируют борной кислотой из расчета 2-3 г на 100 мл сыворотки, или азидом натрия из расчета 1 г на 1 мл сыворотки. Для ускорения свертывания крови сосуд можно поставить сначала на один час в термостат, а затем в холодильник. Паспортизация. На сосуде с кровью, а затем с сывороткой надписывают паспортные данные, т.е. фамилию, имя, отчество донора, групповую принадлежность, дату взятия крови, количество крови и полученной из нее сыворотки, а также результат исследования пробной порции крови. Эти же сведения записывают в "Журнал регистрации материала, поступающего для изготовления стандартной сыворотки" (Дальнейшая обработка, см.пункт IX). ^ Для изготовления сыворотки может быть использована кровь из флакончиков (пробирок)-спутников. Для этого остатки крови сливают (каждую группу отдельно) в сухие флаконы. На флаконе надписывают группу крови и дату заготовки. ^ При получении сыворотки из плазмы из последней удаляется фибрин. Это можно осуществить несколькими способами. 1. К плазме прибавляют раствор хлорида кальция из расчета 3 мл 20% или 6 мл 10% на 100 мл плазмы. Через 30-40 минут во флаконе образуется сверток. Если сверток пристал к стенке, то флакон следует встряхнуть, чтобы сверток отделился. Флакон с содержимым оставляют на двое суток в холодильнике, после чего отделившуюся сыворотку переливают через воронку с марлей в другой флакон. Сыворотку консервируют и на флакон переносят паспортные данные. Иногда во флаконе с сывороткой через некоторое время снова выпадает сверток фибрина, в этих случаях сыворотку еще раз переливают через воронку с марлей (с тканью) в другой флакон. 2. К плазме добавляют равный объем одногруппной сыворотки с титром антител не ниже 1:32. Содержимое флакона перемешивают, оставляют на одни сутки при комнатной температуре и затем помещают в холодильник на 10-14 дней. На паспорте флакона дописывают сведения о дате и количестве добавленной сыворотки. За 10-14 дней образуется плотный сверток фибрина и, кроме того, может исчезнуть свойство вызывать гемолиз или неспецифическую агглютинацию эритроцитов. Отделившуюся сыворотку сливают в другой флакон через воронку с тканью, сыворотку консервируют, на флакон наносят паспортные данные. Паспортизация. Паспортные записи о плазме переносят с флакона на флакон по мере отделения сыворотки. К ним добавляют запись о дате получения сыворотки. Те же сведения записывают в "Журнал регистрации материала,поступающего для изготовления стандартной сыворотки системы АВО". Дальнейшая обработка (см. пункт IX). ^ В тех случаях, когда в процессе лечения больному делается пункция грудной или брюшной полости с целью удаления жидкости, последнюю можно использовать для изготовления стандартной сыворотки. Для этого жидкость собирают в чистую посуду. По доставлении в лабораторию жидкость переливают во флакон через воронку с марлей или тканью для отделения свертка (если он имеется) и консервируют борной кислотой или азидом натрия, как указано выше. Паспортизация. На флаконе надписывают сведения о том, из чего сыворотка приготовлена, и дату. Те же сведения записывают в "Журнал регистрации материала, поступившего для изготовления стандартной сыворотки системы АВО". ^ 1. Серологические исследования. В сыворотке определяют: а) групповую принадлежность (групповые агглютинации); б) гемолизирующие свойства; в) способность вызывать неспецифическую агглютинацию; г) активность, т.е. скорость наступления агглютинации и ее выраженность; д) титр агглютининов. Методы исследования (см.пункт IV). На основании этих исследований делают предварительное заключение о пригодности сыворотки. Основными показателями являются скорость наступления агглютинации и титр антител. ^ , если она вызывавет агглютинацию эритроцитов групп А1 и В не позднее чем через 30 секунд, а эритроцитов группы А2 не позднее, чем через 1 минуту, и если титр агглютининов в ней не ниже, чем 1:32 по отношению к эритроцитам групп А1 и В и не ниже, чем 1:16 по отношению к эритроцитам группы А2. При этом также слоедят за тем, чтобы сыворотка не имела красной или бурой окраски. Если агглютинация наступает позднее или титр агглютининов ниже, сыворотку считают непригодной. Наличие неспецифической агглютинации или гемолизирующих свойств на этой стадии изготовления сыворотки не делает ее непригодной, что позволяет сохранить до 1-го контроля (пункт XI.) 3. Паспортизация. Результаты всех исследований, перечисленных в этом разделе, записывают на флаконе с сывороткой и в "Журнал регистрации материала, поступающего для изготовления стандартной сыворотки". ^ Сыворотку, полученную из крови, взятую непосрдственно у донора, и сыворотку, полученную из любого другого источника и признанную предварительно годной, консервируют. Наиболее пригодным консервантом является борная кислота, которую прибавляют из расчета 2-3 г на 100 мл сыворотки или азид натрия 1 г на 1 мл. После прибавления консерванта сыворотку оставляют на срок 10-12 дней. За этот срок в ней,с одной стороный, может снизится титр агглютининов, с другой - исчезнуть свойство вызывать гемолиз или неспецифическую агглютинацию, если это имело место. Сыворотку, имеющую высокий титр агглютининов, разрешается разводить изотоническим раствором NaCl до титра не ниже 1:64 и соответственно количеству разводителся добавляют борную кислоту или азид натрия. ^ 1. Первый контроль производится через 10-12 дней после поступления сыворотки, ее предваритльногоиспытания и консрвирования. Он заключается в следующем: а) проверяют правильность паспортизации сыворотки, т.е. сверяли записи на флаконе и в журнале; б) определяют групповую принадлежность при помощи стандартных эритроцитов и результат сверяют с обозначением группы крови на флаконе и в журнале; в) одновременно с определение групповой принадлежности проверяют способность сыворотки вызвать неспецифическую агглютинацию и гемолиз эритроцитов; г) проверяют, нет ли в сыворотке признаков инфицирования, не помутнела и не потемнела ли она; д) проверяют активность сыворотки, т.е. скорость наступления агглютинации и титр агглютининов; е) результаты всех исследований записывают на флаконе и в журнал. 2. Заключение о пригодности сыворотки для дальнейшей обработки делается при следующих условиях: если паспортные записи произведены правльно, в сыворотке нет признаков инфицирования, если она не помутнела и не потемнела и обладает достаточной активностью. Под достаточной активностью при первом контроле понимают соответствие требованиям, указанным в разделе II.б. при условии, что титр не только соответствует этим требованиям, но и не снизился более, чем на два разведения по сравнению с исходными цифрами. Если сыворотка отвечает этим условиям, ее считают пригодной для дальнейшей обработки и оставляют еще на 10-12 дней, после чего производят второй контроль (см.п.XIV). При снижении титра более, чем на две ступени (даже если титр сыворотки после снижения остался равным или выше, чем 1:32) сыворотку считают непригодной. При наличии признаков инфицирования, значительного потемнения или помутнения сыворотку считают непригодной. При первом контроле сыворотки явления неспецифической агглютинации и гемолизирующие свойства наблюдаются редко, потому что эти свойства обычно исчезают за время хранения сыворотки с консервантом. Если эти свойства все же сохранились, это не делает сыворотку непригодной для дальнейшей обработки, так как, при некоторых условиях они могут быть устранены в течение времени, предшествующему второму контролю сыворотки. ^ Устранение свойства сыворотки вызывать неспецифическую агглютинацию может быть достигнуто путем разбавления ее изотоническим раствором NaCl. Это допускается только для сыворотки групп О(I) A(II), B(III), и только при высоком титре агглютининов в ней - не ниже ,чем 1:64 - и при этом титре не более, чем половинным объемом изотонического раствора по отношению к объему сыворотки (с добавлением соответствующего количества борной кислоты или азида натрия). Предварительно испытывают ряд пробных разведений сыворотки, приготовленных в небольших количествах. Наблюдение проводят в течение 20 минут. После подбора разведения, устраняющего неспецифическую агглютинацию, разводят всю сыворотку. Если разведение изотоническим раствором NaCl не устраняет неспецифической агглютинации, сыворотку считают непригодной. Развдение сыворотки группы AB(IV) не допускается. Сыворотку, вызывающую хотя бы незначительную неспецифческую агглютинацию, считают непригодной. ^ Для устранения гемолизирующего действия сыворотки ее прогревают при 56°С в течение одного часа. Если такое прогревание не устраняет гемолизирующего действия, сыворотку считают непригодной. ^ 1. Второй контроль роизводят через 10-12 дней после первого (приблизительно через 20-24 дня после начала обработки сыворотки) и проводят так же, как первый контроль (см. раздел XI). 2. Заключение о пригодности сыворотки для дальнейшей обработки делают при следующих условиях: если паспортные записи сделаны правиьно, сыворотка не инфицрована, не помутнела,не потемнела,не вызывает неспецифической агглютинации и гемолиза эритроцитов и достаточно активна. Под достаточной активностью при втором контроле понимают соответствие требованиям, указанным в разделе II, б, при условии, что титр не только соответствует этим требованиям, но и не снизился по сравнению с цифрами, полученными при первом контроле. В других случаях сыворотку считают непригодной. ^ Для максимального использования сырья и упрощения контроля за образцами разлитой сыворотки допускается смешивание нескольких порций одногруппных сывороток после второго контроля их, до розлива (раздел XIX). Предварительно из каждой порции берут по 1-2 млсыворотки и в смеси их определяют титр агглютининов. Затем титр провряют еще раз через 2-3 дня и, если он изменился, то смешивают основные сыворотки. Сыворотку-смесь обозначают новым номером и ее снова испытывают, аналогично второму контролю (раздел XIV). ^ Дополнительным условием, предупреждающем ошибки при определении группы крови, является окрашивание сывороток. Окрашивание можно производить до фильтрации,если предполагается фильтровать сыворотку через бумажный фильтр. При использовании фильтра Зейтца сыворотку окрашивают после фильтрации. Сыворотку группы A(II) окрашивают в синий (или сине-зеленый) цвет. сыворотку группы B(III) - в красный цвет, сыворотку группы AB(IV) - в желтый цвет (см.дополнительно п.XXX). ^ Сыворотку, признанную пригодной, фильтруют. Сыворотку, полученную из крови, взятой непосредственно у донора , обычно достаточно профильтровать через бумажный фильтр. Сыворотку, полученную издругих источников необходимо фильтровать через фильтр Зейтца со стерилизующей прокладкой. Такое фильтрование просветляет сыворотку и предупреждает развитие инфекции. Немедленно после фильтрования сыворотку окрашивают (см. Дополнение 2). ^ Окончательное заключение о пригодности сыворотки делают после ее фильтрования. Сыворотку считают пригодной, если она: а) специфична, т.е. содержит агглютинины a или b, или оба вместе и не вызывает неспецифческой агглютинации эритроцитов; б) активна, т.е. вызывает первые признаки агглютинации в течение первых 30 секунд с эритроцитами групп А1 и В, и в течение одной минуты с эритроцитами группы А2 и имеет титр агглютининов не ниже,чем 1:32 по отношению к эритроцитам А1 и В и не ниже, чем 1:16 по отношению к эритроцитам А2. Для окончательного заключения о пригодности сыворотки, кроме абсолютной величины титра, принимают во внимание его динамику (мс. раздел XI, первый контроль и раздел XIV, второй контроль); в) не оказывает на эритроциты гемолизирующегодействия; г) прозрачна. Допускается небольшая опалесценция; д) предохранена от инфицирования консервированием; е) имеет точную паспортизацию. При соответствии этим требованиям сыворотке присвавается номер серии и она может быть разлита и выпущена как стандартная изогемагглютинирующая сыворотка для определения групп крови АВО с соответствующей записью в "Журнале регистрации изготовленной стандартной сыворотки системы АВО". ^ Сыворотку групп Оab(I), Aa(II), Ba(III) разливают во флаконы или ампулы по 1-5 мл, сыворотку AB(IV) - по 0,5 мл. Запрещается разливать сыворотки разных групп одновременно в одном помещении. Немедленно после розлива на флаконы (ампулы) наклеивают этикетки. Флаконы закупоривают, ампулы запаивают. ^ 1. Этикетки, наклеиваемые на флаконы (ампулы) с разлитой сывороткой, должны содержать следующие сведения: а) название учреждениея, в котором изготовлена сыворотка; б) групповую принадлежность сыворотки с обязательным указанием агглютининов; в) номер серии; г) титр агглютининов в сыворотке. Титр a-агглютинина указывается по отношению к эритроцитам группы А1. Для сыворотки группы Оab(I) указывается титр только одного агглютинина a или b и из них того,который слабее; д) срок годности: число, месяц, год; е) на этикетке нансят по диагноали цветные полосы: - для группы A(II) - две синие. - для группы B(III) - три красные. - для группы AB(IV) - четыре желтые. 2. Этикетки изготавливают типографским способом, оставляя свободные места для цифровых обозначений (номера серии, титра и срока годности), которые вносят на этикетку к моменту розлива. Форму этикетки - см. Рисунок 1. 3. Сыворотку ,разлитую во флаконы (ампулы), регистрируют в "Журнале регистрации изготовленной стандартной сыворотки системы АВО".
Рис.1. Форма этикеток стандартных изогемагглютинирующих сывороток системы АВО. На этикетки наносят по диагноали цветные полосы: - для сыворотки группы Аb(II) - две синие; - для сыворотки группы Вa(III) - три красные; - для сыворотки группы АВо(IV) - четыре желтые. Возможно печатать таким же цветом полностю текст этикеток. ^ Срок годности стандартной сыворотки устанавливают 6 месяцев с момента ее розлива. Сыворотку, срок годности которой истек, можно проверить при условии, если она сохранила без изменения свои свойства (см. разд.XVIII), продлить срок годности еще на 2 месяца. ^ Контроль разлитой сыворотки производят в пределах ее годности. Для этого из каждой серии разлитой сыворотки в лаборатории оставляют несколько ампул, которые сохраняют как образцы для последующего контроля. Контроль заключается в проверке внешнего вида сыворотки и сохранения ее специфичности и активности. При контрольной проверке к сыворотке предъявляют следующие требования: а) отсутствие помутнения,выпадения осадка и потемнения; б) отсутствие способности вызывать неспецифичную агглютинацию и гемолиз эритроцитов; в) наступление агглютинации с эритроцитами групп А1 и В не позднее, чем в течение 30 секунд и с эритроцитами группы А2 не позднее, чем в течение одной минуты; г) сохранение титра агглютининов на высоте, установленной при втором контроле сыворотки до розлива. Если титр снизился (не более, чем на одну ступень), но высота его не ниже требований,указанных в разделе II,б, то сыворотку проверяют еще через пять и десять дней. Если титр далее не снижается, сыворотку считают пригодной. ^ При контроле сыворотки титр можно определять более простым способом. Испытуемую сыворотку разводят изотогическим раствором NaCl соответственно указанному на ней титру. Например, при титре 1:64 в пробирку накапывают 63 капли изотонического раствора и той же пипеткой одну каплю испытуемой сыворотки. Сыворотку тщательно перемешивают с изотоническим раствором и одну каплю смеси переносят на пластинку. Сюда же прибавляют одну маленькую (приблизительно в 10 раз меньшую) каплю стандартных эритроцитов соответствующей группы. Эритроциты перемешивают с сывороткой и наблюдают за результатом при покачивании пластинки в течение пяти минут. Если за это время появилась агглютинация, значит, титр сыворотки не снизился. Если в течение пяти минут агглютинация ненаступила, значит, титр снизился. В этих случаях для установления величины титра сыворотку титруют вновь,как указано в разделе IV,5. ^ Если при контроле разлитой сыворотки окажется, что она несоответствует предъявленным требованиям (см. раздел XXII,а, б, в, г), то сыворотку считают непригодной и ликвидируют. В учреждении, в которые эта сыворотка была отпущена,немедленно сообщают по телефону и телеграфом о непригодности данной серии сыворотки. Сыворотку, возвращенную из других учреждений из-за непригодности ликвидируют так же, как сыворотку этой серии, оставшуюся неиспользованной в лаборатории, ее изготовившей. ^ Сыворотку выдают по требованиям учреждений, в которых определяют группу крови. Выдают сыворотку комплектом в равных количествах групп Оab(I), Аb(II), Вa(III), АВо(IV) выдают по 1 мл на 15 мл общего количества сыворотки других трех групп. При выдаче сыворотки к ней обязательно прикладывают инструкцию по использованию (см.п.XXIX, Дополнение1) ^ Сыворотку на всех стадиях ее изготовления можно хранить при комнатной температуре или в холодильнике при 4-8°С. Если сыворотка замерзла, это не меняет ее свойства и она может быть использована после ее оттаивания. ^ Под паспортизацией подразумевают запись на флаконе всех сведений о находящейся внем порции исходногоматериала, из которого получается сыворотка, и последовательную запись всех результатов, полученных при исследовании исходного материала, а затем сыворотки в процессе ее изготовления и контроля. Паспортные записи производятся: а) на флаконе с исходным материалом. Эти записи постепенно пополняются и переносятся с флакона на флакон по мере обработки и исследования этой порции сыворотки; б) на этикетке, наклеиваемой на флакон или ампулы с разлитой сывороткой; в) в "Журнале регистрации материала, поступающего для изготовления стандартной сыворотки системы АВО"; г) в "Журнале регистрации изготовленной стандартной сыворотки системы АВО". ^ а) В "Журнал регистрации материала, поступающего для изготовления стандартной сыворотки системы АВО" записывают все сведения о поступившем материале и полученной из него сыворотки, включая контрольные исследования, проведенные до момента розлива сыворотки. При смешивании сывороток различных серий смесь записывают под новым номером. Записи в этом журнале повторяют записи на флаконах с неразлитой сывороткой. б) В "Журнал регистрации изготовленной стандартной сыворотки системы АВО" записывают сведения о сыворотке с момента ее розлива. В этот журнал вносят сведения, имеющеся на этикетке разлитой сыворотки, и делают дополнительные записи о дате розлива и результатах контрольных проверок разлитой сыворотки. В этот же журнал записывают, куда исколько было отпущено сыворотки каждой серии. Нумерацию серий начинают с 1 января каждого года и ведут независимо от групповой принадлежности сыворотки. Дополнение 1 ^ (прилагается при выдаче сыворотки) Техника реакции. Определение группы крови АВО производится стандартными изогеагглютинирующими сыворотками на плоскости при комнатной тепературе. Стандартные сыворотки наносят на белую пластинку со смачиваемой поверхностью по одной большой капле (0,1 мл) у предварительно надписанного обозначения. Во избежение ошибки при каждом определении группы крови применяют по два образца сывороток каждой группы (разные серии), так что они образуют два ряда капель в следующем порядке по горизонтали: Оab(анти-(А+В)), Аb(анти-В) и Вa(анти-А). Исследуемую крови наносят по одной маленькой капле, приблизительно в 10 раз меньше капли сыворотки (0,01 мл), рядом с каждой каплей сыворотки. Кровь тщательно перемешивают с сывороткой стеклянной палочкой или углом предметного стекла, которые промывают и досуха вытирают перед размешивание каждой капли. ^ Наблюдение за ходом реакции произвдят при легком покачивании пластинки в течение пяти минут. Результат реакции в каждой капле может положительным (+) или отрицательным (-). Положительный результат (+) выражается в агглютинации (склеивании) эритроцитов- агглютинаты видны невооруженным глазом сначала в виде мелких красных зернышек, постепенно сливающихся в более крупные хлопья. При этом сыворотка постепенно обесцвечивается. При отрицательной реакции (-) капля остается равномерно окрашенной. Агглютинация наступает обычно в течние 10-30 секунд, однако наблюдение проводят в течение не менее пяти минут ввиду возможности позднего наступления агглютинации в случае слабой агглютинабельности эритроцитов (А2 или А2В). По мере наступления агглютинации, но не ранее трех минут, в эти капли добавляют по одной большой капле (0,1 мл) изотонического раствора NaCl для разрушения иногда наступающей ложной агглютинации - неспецифического склеивания эритроцитов, в том числе в так называемые монетные столбики. В тех случаях, когда положительный результат получается со стандартными сыворотками всех групп (во всех каплях), для исключения неспецифической агглютинации производится дополнительное контрольное иследование испытуемых эртроцитов со стандартной сывороткой группы АВо(IV), не содержащей групповых агглютининов. Лишь отсутствие агглютинации с сывороткой группы АВо(IV) позволяет учесть положительный рзультат реакции с сыворотками Оab(I) (анти-А+В), Аb(II) (анти-В) и Вa(III) (анти-А) как истинный.
Таблица 1. Оценка результатов определения групп крови при помощи изогеагглютинирующих сывороток двух серий каждой группы Знаком (+) обозначено наличие агглютинации, знаком (-) - отсутствие ее. Примечание 1. При использовании сывороток с титром не ниеж, чем 1:64 разрешается проводить первичное определение группы крови у доноров и больныходной серией сывороток каждой группы.При повторном и перекрестном определении можно использовать также сыворотки одной серии (с титром не ниже, чем 1:64), но отличающиеся от тех серий, которые были применены при первичном определении. 2. Уточнение техники реакции, оценки результатов, возможные ошибки и другие подробности см. в "Инструкции по определению групп крови системы АВО". Дополнение 2. ^ Для окрашивания изогемагглютинирующих сывороток используются следующие красители: - для сыворотки группы Аb(II) - метиленовая синяя, бриллиантовая зелень и трипан-блау вместе или любые две из них, взятые в равных количествах; - для сыворотки группы Вa(III) - эозин натрия или конгорт; - для сыворотки группы АВо(IV)- уранин (флуоресцеин растворимый - динатрий флюоресцеинат). Краски растворяют в дистиллировнной воде или изотоническом растворе NaCl до получения пересыщенного раствора (1 гр. на 50 мл жидкости). Краситель приготавливают исходя из потребности 50-100 мл и сохраняют для использования. При изготовлении сывороток немедленно после фильтрования соответствующие растворы красок добавляют по 3-5кпель на каждые 100 мл сыворотки до получения требуемой окраски: синий или сине-зеленый для группы Аb(II), светло-красный для группы Вa(III) и желтый для группы АВо(IV). Следует иметь ввиду,что иногда при хранении запаянных ампул на свету синяя краска в сыоротке группы Аb(II) слегка выцветает, но она восстанавливается после вскрытия ампулы (флакона). Использование красок безвредно для сывороток, не влияет на титр и срок их годности. Приложение 3 УТВЕРЖДЕНО Приказ Минздрава России от 09.01.1998г. №2 ^ Введение Под группами крови АВО подразумеваются различные сочетания антигенных свойств эритроцитов (агглютиногенов) и антител по отношению к ним (агглютининов), находящихся в плазме крови. Существуют два групповых агглютиногена А и В, и два агглютинина - a и b. Различные сочетания этих свойств образуют четыре группы крови: Оab(I), Ab(II), Ba(III) и ABо(IV). Возможны два способа определения группы крови: 1. Определение группы крови при помощи стандартных изогемагглютинирующих сывороток. При этом способе в крови устанавливают наличие или отсутствие агглютиногенов и, исходя из этого делают заключение о групповой принадлежности исследуемой крови. 2. Определение группы крови перекрестным способом, т.е. одновременно при помощи стандартных изогемагглютинирующих сывороток и стандартных эритроцитов. При этом способе, так же как и при первом, определяют наличие или отсутствие агглютиногенов и кроме того, при помощи стандартных эритроцитов устанавливают наличие или отсутствие групповых агглютининов. Группа крови у больных и других лиц, которым предполагают переливание крови, определяется сертифицрованным специалистом, имеющим специальную подготовку. Во избежание ошибки процедуру взятия крови и определения группы повторяют. Результат определения группы крови записывается в правом верхнем углу лицевого листа истории болезни с указанием даты и за подписью специалиста, производившего определение. Группа крови доноров определяется два раза сертифицированным специалистом: один раз при первичном обращении донора при помощи стандартных сывороток двух различных серий каждой группы; и второй раз при окончательном зачислении в доноры - перекрестным способом, т.е. одновременно при помощи стандартных (также двух различных серий каждой группы) и стандартных эритроцитов. Результат обоих определений записывается на лицевой стороне донорского журнала (карты) с указанием даты и за подписью лиц, определявших группу крови. Примечание: При использовании изогемагглютинирующих сывороток с титром не ниже, чем 1:64 разрешается проводить первичное определение группы крови у доноров и больных одной серией сыворотки каждой группы. При повторном и перекрестном определении можно использовать также сыворотки одной серии (с титром не ниже, чем 1:64), но отличающихся от тех серий, которые были применены при первичном определении. ^ а. Стандартные изогемагглютинирующие сыворотки групп 0ab(I), Aa(II), Ba(III) и стандартная сыворотка группы ABo(IV). б. Стандартные эритроциты групп 0(I), A(II) и B(III)* в. Изотонический раствор NaCl. г. Белые фарфоровые или любые другие белые пластинки со смачиваемой поверхностью. д. Пипетки. е. Стеклянные или пластмассовые палочки для перемешивания капель крови и сыворотки. * Стандартные эритроциты приготавливаются учреждениями службы крови в консервированном виде. Можно использовать и нативные свежие стандартные эритроциты, приготовленные малыми дозами в соответствии с действующей инструкцией по их изготовлению. ^ а. Определение группы крови производят в помещении с хорошим освещением при температуре 15-25°С. б. Ампулы, флаконы со стандартными сыворотками ставят в штатив с тремя гнездами (или в два штатива - при использовании двух серий каждой группы). В левые гнезда ставят сыворотку группы 0a(I), в средние - сыворотку группы Ab(II) и в правые - сыворотку группв Ba(III). В ампулы опускают сухие чистые пипетки. Отдельно ставят сыворотку группы ABo(IV), употребляемую в качестве дополнительного контроля (см. раздел IV. в). Этот набор дополняют пробиркой или флаконом с изотоническим раствором NaCl. в. Для определения группы крови перекрестным способом, кроме стандартных сывороток, подготавливают также стандартные эритроциты групп 0(I), A(II) и B(III). Пробирки со стандартными эритроцитами устанавливают в маленький (три гнезда) штатив в следующем порядке: слева - группы 0(I), в середине - группы A(II) и справа - группы B(III). г. Для промывания стеклянных, пластмассовых палочек и пипеток подготавливают стаканы с водой и изотоническим раствором Na Cl. ^ а. На левой стороне пластинки надписывают Оab [анти-(А+В)], в середине - Аb(анти-В) и справа - Вa(анти-А), на верхнем крае - фамилию и инициалы лица, у которого определяют группу крови. Под соответствующим обозначением группы крови на пластинку наносят по одной большой капле (0,1 мл) стандартной сыворотки соответствующей группы. Если используют стандартные сыворотки двух различных серий каждой группы, всего получается 6 капель, которые образуют два ряда по три капли в следующем порядке слева направо: 0ab[анти-(А+В)], Аb(анти-В) и Вa(анти-А). Сыворотку берут из ампулы пипеткой, которую тотчас же после того, как из нее была выпущена сыворотка, опускают в ту же ампулу с сывороткой из которой она была взята. б. Кровь для исследования беоут из места укаола мякоти пальца или мочки уха. Капли крови величиной приблизительно 0,01 мл последовательно наносят сухой стеклянной палочкой на пластинку,каждую рядом с каплей стандартной сыворотки (количество испытуемой крови должно быть приблизительно в 10 раз меньше количества стандартной сыворотки, с которой она смешивается). в. Другой стеклянной палчкой перемешивают каплю крови с сывороткой группы Оab[анти(А+В)] до тех пор, пока смесь не окрасится равномерно в красный цвет. Другой стеклянной палочкой перемешивают следующую каплю крови с сывороткой группы Аb(анти-В) и так же поступают с сывороткой Вa(анти-А). При использовании двух серий сывороток так же делают во втором ряду. Можно перемешивать кровь с сывороткой одной и той же палочкой, но в этом случае необходимо после размешивания каждой капли промывать палочку в стакане с водой и насухо ее вытирать. г. После размешивания капель пластинку покачивают, затем на 1-2 минут оставляют в покое и снова периодически покачивают. Наблюдение за ходом реакции проводят не менее пяти минут. Хотя агглютинация начинается в течение первых 10-30 секунд, наблюдение следует вести и далее - до пяти минут в виду возможности более поздней агглютинации, например с эритроцитами группы А2(II). д. По мере наступления агглютинации, но не ранее чем через 3 минуты, в капли смеси сыворотки с эритроцитами, в которых наступила агглютинация, добавляют по одной капле (0,05мл) изотонического раствора NaCl и продолжают наблюдение при периодическом покачивании пластинки до истечения пяти минут. ^ Реакция гемагглютинации в каждой капле может быть положительной или отрицательной. При положительной реакции обычно в течение первых 10-30 секунл от начала перемешивания в смеси появляются видимые невооруженным глазом мелкие, красные комочки (агглютинаты), состоящие из склеенных эритроцитов. Мелкие комочки постепенно сливаются в более крупные, а иногда в хлопья неправильной формы. При этом сыворотка полностью или почти полностью обесцвечивается. При отрицательной реакции жидкость все время (5 минут) остается равномерно окрашенной в красный цвет и в ней не обнаруживается никаких агглютинатов. Результаты реакций в каплях с сывороткой одной и той же группы должны совпадать. Результаты с сыворотками трех групп Оab[анти-(А+В)], Аb(анти-В) и Вa(анти-А) могут дать четыре различные комбинции положительных и отрицательных реакций (см. табл.1). а. Если сыворотки вех трех групп дали отрицательную реакцию, т.е. все смеси остались равномерно окрашенными в красный цвет без признаков агглютинации, это значит, что кровь не содержит агглютиногенов А и В, т.е. принадлежит к группе О(I). б. Если сыворотки групп Оab[анти(А+В)] и Вa(анти-А) дали положительную реакцию, а сыворотка группы Аb(анти-В) - отрицательную, это значит, что кровь содержит агглютиноген А, т.е. принадлежит к группе А(II). в. Если сыворотки групп Оab[анти(А+В)] и Аb(анти-В) дали положительную реакцию, а сыворотка группы Вa(анти-А) - отрицательную, то исследуемая кровь содержит агглютиноген В, т.е. принадлежит к группе В(III). г. Если сыворотки всех трех групп дали положительную реакцию, то это указывает на то, что исследуемая кровь содержит оба агглютиногена - А и В, и принадлежит к группе АВ(IV). Однако, в этих случаях для исключения неспецифической агглютинабельности исследуемых эритроцитов необходимо провести дополнительное контрольное исследование со стандартной сывороткой группы АВо(IV). Для этого на пластинку наносят большубю каплю (0,1 мл) сыворотки группы АВо(IV) (контроль) и к ней добавляют маленькую (0.)! мл) каплю исследуемой крови. Сыворотку и кровь перемешивают, после чего наблюдают за результатом в течение 5 минут при покачивании пластинки. Лишь отсутсвие агглютинации в этой капле, при наличии ее в каплях, содержащих стандартные сыворотки групп Оab[анти(А+В)], Аb(анти-В0 и Вa(анти-А), позволяет считать реакцию специфической и отнести исследуемую кровь к группе АВ(IV). ^ а. Определение группы крови перекрестным способом заключается в одновременном определении групповых агглютиногенов в эритроцитах испытуемой крови при помощи стандартных сывороток и групповых агглютининов в сыворотке исследуемой крови при помощи стандартныхэрироцитов. б. Для определения группы крови перекрестным способом кроме стандартных сывороток используют стандартные эритроциты группы O(I), A(II) и B(III). в. Кровь для исследования берут из вены или места укола пальца в сухую пробирку. Кровь центрифугируют или оставляют в покое на 20-30 минут для отделения сыворотки (для лучшего отделения сыворотки через 3-5 минут следует отделить сверток от стенок пробирки, обведя его стеклянной палочкой). г. Определение производят на белой пластинке, на верхнюю часть которой наносят обозначения слва направо: Оab[анти(А+В)], Аb(анти-В) и Вa(анти-А). На верхнем крае надписывают фамилию и инициалы лица,у которого определяют группу крови. д. Под соответствующими обозначениями групп крови на пластинку наносят по одной большой капле (0,1 мл) стандартных изогемагглютинирующих сывороток. При использовании стандартных сывороток двух различных серий каждой группы, всего получается 6 капель, которые образуют два ряда по три капли в ледующем порядке слева направо: Оab[анти(А+В)], Аb(анти-В) и Вa(анти-А). е. На правую часть пластинки также под соответсвующими обозначениями наносят по одной маленькой (0,01 мл) капле стандартных эритроцитов в следующем порядке слева направо: O(I), A(II) и B(III). ж. Из пробирки, содержащей кровь больного, пипеткой извлекают сыворотку (осторожно, чтобы не взболтать эритроциты) и накапывают ее по одной большой (0,1 мл) капле на подготовленные стандартные эритроциты. После этого той же пипеткой набирают со дна пробирки эритроциты испытуемой крови и наносят их по маленькой (0,01 мл) капле рядом с каждой каплей подготовленной стандартной сыворотки. з. Во всех каплях сыворотку тщательно перемешивают с эритроцитами (сухой стеклянной палочкой), пластинку покачивают, затем на 1-2 минуты оставляют в покое и снова периодически покачивают. Наблюдение за ходом реакции проводят не менее пяти минут. Агглютинация в капялх со стандартной сывороткой обычно начинается быстро (10-30 секунд). Агглютинация в каплях, в которых сыворотку крови испытывают со стандартными эритроцитами, может наступить поздно ( к концу пятой минуты), в связи с возможностью низкого титра содержащихся в исследуемой сыворотке агглютининов. и. По мере наступления агглютинации, но не ранее чем через 3 минуты в те капли, в которых она наступила, добавляют по одной капле (0,05 мл) изотонического раствора NaCl и продолжают наблюдение при покачивании пластинки до истечения пяти минут. ^ Учет реакции производится путем сопоставления результатов, полученных при помощи стандартных сывороток и стандартных эритроцитов (см. табл.2) Результаты реакций, полученных при помощи стандартных сывороток и стандартных эритроцитов, должны совпадать, т.е. указывать на содержание агглютиногенов и агглютининов, соответствующих одной и той же группе крови. Эти результаты могут быть выражены в четырех различных комбинациях. а. Реакция со стандартными сыворотками указывает на отсутствие групповых агглютиногенов, т.е на принадлежность исследуемой крови к группе 0(I) (см. раздел IV, а). При этом сыворотка исследумой крови (нижний ряд) дает отрицательную реакцию со стандартными эритроцитами группы 0(I) и положительную - с эритроцитами групп A(II) и B(III). Это указывает на наличие в исследуемой крови агглютининов a и b, т.е. подтверждает принадлежность исследуемой крови к группе Оab(I). б. При помощи стандартных сывороток в исследуемой крови устанавливается наличие агглютиногена А (см. раздел IV, б). При этом сыворотка исследуемой крови дает отрицательную реакцию со стандартными эритроцитами групп 0(I) и А(II), но положительную с эритроцитами группы В(III). Это указывает на наличие в исследуемой крови агглютинина b, т.е. подтверждает принадлежность испытуемой крови к группе Аb(II). в. При помощи стандартных сывороток в исследуемой крови определяется наличие агглютиногена В (раздел IV,в). При этом сыворотка исследуемой крови дает отрицательную реакцию со стандартными эритроцитами групп 0(I) и В(III), но положительную с эритроцитами группы А(II). Это указывает на наличие в исследумой крови агглютинина a, т.е. подтверждает принадлежность крови к группе Вa(III). г. При помощи стандартных сывороток в исследуемой крови устанавливается наличие агглютиногенов А И В, а исследование с контрольной сывороткой группы AB(IV) подтверждает специфичность реакции (см раздел IV, г). При этом сыворотка исследуемой крови дает отрицательную реакцию со стандартными эритроцитами всех трех групп, что указывает на отсутствие агглютининов в исследуемой крови, т.е. подтверждает принадлежность испытуемой крови к группе ABo(IV). ^ Отступление от изложенных правил может привести к ошибочным заключениям о групповой принадлежности исследуемой крови. Отступлением от правил могут явиться: ошибочный порядок расположения стандартных сывороток или эритроцитов в штативах, ошибочный порядок нанесения их на пластинку, неправильное соотношение количества сыворотки и эритроцитов, несоблюдение времени, необходимого для проведения реакции (15 минут),не использование контрольной реакции с сывороткой группы АВo(IV), загрязнение или применение мокрых пипеток, пластинок, палочек, а также использование недоброкачественных стандартов, например, сыворотки с истекшим сроком годности (недостаточно активной), загрязненной или частично высохшей сыворотки, которая может вызывать неспецифичскую реакцию агглютинации и т.д. Эти отступления и связанные с ними ошибки могут привести к неправильной оценке результата реакции в целом и в каждой отдельной капле. Последнее может заключиться в следующем: Лицо, определяющее группу крови, считает, что агглютинации не произошло, в то время как она фактически есть или должна появться. Лицо, определяющее группу крови, предполагает, что произошла агглютинация, в то время как она фактически отсутствует. Первая ошибка, т.е. учет реакции как отрицательной при фактическом наличии агглютинации, может произойти: а) в тех случаях, когда агглютинация начинается поздно или бывает слабо выражена. Это может зависеть от того, что стандартные сыворотки мало активны, или от того, что эритроциты исследуемого лица обладают слабой агглютинабельностью. При одновременном наличии двух причин агглютинация может совсем не появиться, например, если малоактивная сыворотка группы Вa(анти-А) не даст агглютинации с эритроцитами группы А(II), если агглютинабельность последних низкая, например, подгруппа А2. Во избежание этой ошибки необходимо наблюдать за ходом реакции не менее пяти минут и особенно внимательно за теми каплями, в которых еще не наступила агглютинация, а также работать только с активными сыворотками, агглютинирующая способность которых проверена, соответствует требованиям инструкции и в пределах срока ее годности. б) при избытке крови,если взята слишком большая капля. Во избежание этой ошибки следует соблюдать соотношение объема исследуемой крови и стандартной сыворотки (или стандартных эритроцитов и исследуемой сыворотки) приблизительно 1:10; в) при высокой температуре (выше 25°С) окружающего воздуха, например, в жаркую погоду (см. раздел II, а). Во избежание этой ошибки пластинку, на которой определяется группа исследуемой крови, следует охладить.. Вторая ошибка, т.е. учет реакции как положительной при фактическом отсутствии агглютинации, может произойти: а) когда эритроциты испытуемой крови складываются в "монетные столбики", которые невооруженным глазом можно принять за агглютинанты. Во избежание этой ошибки необходимо добавление раствора NaCl (см. раздел III, д) с последующем покачиванием пластинки, что, как правило, уничтожает "монетные стольики"; б) когда исследуемые эритроциты дают феномен ауто- или панагглютинации. Во избежание этой ошибки необходимо не допускать определения групп крови при температуре ниже 15°С (см. раздел II, а) и обязательно использовать контрольные сыворотки группы АВо(IV) (см. раздел IV, г); в) при использовании недоброкачественной сыворотки, дающей неспецифическую агглютинацию. Во избежание этой ошибки следует просматривать ампулы (флаконы) со стандартной сывороткой и не использовать ее, если в ней имеются помутнение или признаки высыхания. г) когда пластинку со смесью эритроцитов и сыворотки не покачивают. В этом случае эритроциты, оседая на дно,могут образовать отдельные скопления, симулирующие агглютинацию. Во избежание этой ошибки необходимо периодически покачивать пластинку, на которой проводится определение (см. раздел III, г и раздел V, з). Однако и при правильной оценке реакции в каждой отдельной капле можно сделать неправильное заключение о групповой принадлежности, если спутать порядок расположения стандартов в штативе или на пластинке. Поэтому каждый раз в начале работы по определению групповой принадлежности следует тщательно проверять расположение в штативах пробирок со стандартными эритроцитами, а также всех ампул (флаконов) с сывороткой, их групповую принадлежность, номер серии и дату годности. Во всех случаях нечеткого или сомнительного результата необходимо повторное определение группы крови при помощи стандартных сывороток других серий. Если результаты также остаются неясными, а определение проводилось только при помощи стандартных сывороток, то следует определить группу крови также и перекрестным способом. |
||||||||||||||||||||||||||||||||
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям