Приказ Минздрава России от 09. 01. 1998г. №2 инструкция по предупреждению несовместимости при переливании крови I. Введение > 1
|
|
Скачать 2.36 Mb.
|
|
Оснащение: специально приготовленные сыворотки анти-К универсальные, физиологический раствор NaCl, пластинки (тарелки) с гидрофильным покрытием, стеклянные палочки, песочные часы. Для исследования использую свежие - не более 2-х дневоного хранения, неотмытые или отмытые эритроциты, взятые со дна пробирки после отстаивания от сыворотки (третья фракция эритроцитов), плазмы с консервантом или физиологического раствора. Используют также цельную кровь, взятую из прокола пальца непосредственно перед исследованием. ^ на плоскость помещают одну каплю (0,05-0,06 мл)* сыворотки анти-К и каплю эритроцитов в количестве 1/3 объема взятой сыворотки. Капли перемешивают стеклянной палочкой и при плавном периодическом покачивании пластинки наблюдают за ходом реакции в течение 5 минут. ^ при положительном результате агглютинация эритроцитов появляется к 30 сек - 1 мин. и в дальнейшем усиливается, при отрицательном результате агглютинация отсутствует. По истечении 3-4 минут в реагирующую смесь добавляют 1-2 капли физиологического раствора для снятия возможной неспецифической аггрегации эритроцитов и продолжают наблюдение до истечения 5 минут, после чего регистрируют результат. Примечание: * 1мл сыворотки анти-К расходуется на 15-20 исследований. ВНИМАНИЕ! Во избежание ошибок рекомендуется использовать осадок эритроцитов, максимально освобожденный от взвешивающей среды. Срок годности сывороток - четыре месяца. Приложение 16 УТВЕРЖДЕНО Приказ Минздрава России о 09.01 1998г. №2 ИНСТРУКЦИЯ ^ 1. Выбор доноров для иммунизации К иммунизации антигенами системы резус могут привлекаться доноры-мужчины от 18 до 50 лет и женщины от 45 до 50 лет или моложе, если у них уже наступила менопауза. Реиммунизация может производиться лицам, ранее сенсибилизированным к антигену резус вследствие резус-конфликтных беременностей или введения им крови. Иммунизацию и реиммунизацию проводят только после ознакомления с сущностью данной процедуры привлекаемых для этого лиц с их согласия, данного в письменной форме. Перед иммунизацией и реиммунизацией доноры и сенсибилизированные лица, привлеченные к донорству, проходят врачебное освидетельствование согласно "Инструкции по медицинскому освидетельствованию доноров крови, плазмы, клеток крови", утвержденной Министерством здравоохранения Российской Федерации 29 мая 1995 года. Медицинское освидетельствование повторяется перед каждым курсом иммунизации и реиммунизации. Наличие в анамнезе у женщин выкидешей, мертворождений, гемолитической болезни у их новорожденных и другой патологии, связанной с резус-конфликтом, не является противопоказанием к иммунизации, реиммунизации и последующему взятию крови и плазмы (плазмаферез). У этого контингента лиц допускается также содержание гемоглобина не менее 120 г/л, количества эритроцитов - не менее 3,7х10(12)/л, лейкоцитов до 10х10(9)/л, палочкоядерных нейтрофилов до 10%, лимфоцитов до 45%. У лиц, дающих согласие на иммунизацию и реиммунизацию, проводят исследования на антиген гепатита B, антитела к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ) и на содержание аланинаминотрансферазы. Эти исследования повторяют перед каждым курсом иммунизации и реиммунизации. К иммунизации допускаются лица, не содрежащие в крови антигена гепатита В, антител к гепатиту С, вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ) и с содержанием аланинаминотрансферазы в пределах нормы. Эритроциты лиц, отобранных для иммунизации, и доноров, кровь которых будет использована в качестве антигена, титруют по антигенам системы резус: D, С, Е, с, е и по возможности других систем (Келл, Даффи и т.д.) До иммунизации сыворотку крови этих лиц проверяют на наличие различных форм резус-антител, а эритроциты - прямой пробой Кумбса. Положительный результат прямой пробы Кумбса является противопоказанием для иммунизации и реиммунизации, так же как и вообще для зачисления в доноры. При наличии резус-антител устанавливают специфичность и титр. Если эти показатели не дают возможности изготовления из этой крови стандартной сыворотки или иммуноглобулина антирезус, то для пвышения активности антител такому лицу можно проводить реиммунизацию. После иммунизации и реиммунизации донору должна быть выдана справка о том, какую кровь следует подбирать ему в случае необходимости гемотрансфузии. Справка должна быть напечатана на картоне или плотной бумаге, отвечающей условиям длительного хранения, и помещена в прозрачный влагоустойчивый конверт. В справке должны быть указаны следующие сведения: - город и название учреждения, производившего иммунизацию и выдавшего справку; - фамилия, имя, отчество донора; - группа крови по системе АВО; - резус-принадлежность (фенотип); - чем иммунизировали (резус-антиген); - при необходимости гемотрансфузии обязателен индивидуальный подбор совместной крови только резус .......................... лиц. Справка должна быть подписана руководителем учреждения с указанием даты и скреплена печатью. ^ Анигеном для резус-иммунизации служат эритроциты консервированной крови активных доноров группы O(I) или одноименной с кровью иммунизируемого лица. Помимо полного обследования, предусмотренного для доноров, дающих кровь для переливания больным, донор антигена должен быть обследован два раза в год у врача-инфекциониста с целью исключения латентно протекающего заболевания печени. Для иммунизации применяется кровь, содержащая антиген, против которого предполагается получить антитела. Этот антиген должен отсутствовать у лица, которое иммунизируется этой кровью. Рекомендуется для каждой группы лиц (в количестве до десяти человек) использовать для иммунизации эритроциты одного и того же донора. Кровь, используемая в качестве антигена, заготавливается стерильно в мелкой расфасовке на любом консервирующем растворе и годна к употреблению семь дней. После вскрытия флакона путем прокола пробки кровь должна быть использована сразу для иммунизации одного или нескольких доноров. Оставлять кровь после вскрытия флакона до прихода следующей группы доноров воспрещается. Для иммунизации могут быть использованы также криоконсервированные размороженные эритроциты со сроком хранения, предусмотренными для этой среды. Для иммунизации рекомендуется отбирать эритроциты с высокой активностью соответствующих резус-антигенов. О ней судят по быстроте наступления и характеру агглютинации эритроцитов с антисывороткой соответствующей специфичности. При иммунизации антигенами C и E в течение курса рекомнедуется для каждого иммунизируемого лица применять эритроциты одного и того же донора, преимущественно свежеконсервированные. ^ Инъекции антигена прводят в условиях соблюдения асептики, в специально отведенном помещении, в котором не производится работа с сыворотками. Помещение должно быть оборудовано бактерицидными лампами и проточной холодной и горячей водой. Перед иммунизацией проводят влажную обработку помещения с применением антисептиков. Для иммунизации применяют шприцы одноразовго пользования, а при отсутствии - обычные шприцы, которые должны быть автоклавированы. Перед началом и на 8-30 день после окончания каждого курса иммунизации у донора необходимо взять кровь для исследования на наличие, специфичность и активность антител. Ниже приводятся схемы иммунизации и реиммунизации доноров антигенами системы резус. Однако при необходимости в этих схемах могут быть допущены некоторые отклонения в сроках введения антигена - до пяти дней между инъекциями и до полутора месяцев между курсами, и в дозах - в пределах ± 5. При всех схемах иммунизации и реиммунизации кровь, используемая в качестве какого-либо антигена резус, должна быть отрицательной по фактору Келл. ^ Для получения антитела анти-D рекомендуется иммунизировать лиц фенотипа ccddee, используя в качестве антигена эритроциты фенотипа ccDee. Однако следует иметь в виду, что в процессе такой иммунизации иногда, кроме антител анти-D, абразуются антитела анти-C. Для избежания этого можно привлекать к иммунизации лиц фенотипа Ccddee, применяя в качестве антигена кровь фенотипа ccDee, а также фенотипа CcDee. Иммунизация лиц гомозиготных по антигену C, т.е. фенотипа CCddee кровью вышеуказанных генотипов не разрешается ввиду возможности образования у них антител анти-с. ^ Первый курс состоит из трех внутривенных или внутримышечных инъекций крови донора-антигена в количестве: первая - 10 мл крови, последующие две инъекции - по 5 мл с интервалами между ними три-четыре дня. Через четыре месяца проводят второй курс иммунизации. Второй курс состоит из трех внутривенных или внутримышечных инъекций крови донора-антигена по 5 мл на каждую с интервалами по три-четыре дня. Третий и четвертый курсы: донорам, у которых за два курса не вырботалось антител, через шесть месяцев после воторого курса следует провести третий и четвертый курсы иммунизации, аналогичные второму курсу. Если после четвертого курса у донора не вырабатывается антител, через четыре месяца, и в дальнейшем с теми же интервалами следует провести сокращенные курсы по типу реиммунизации. Если и после такой длительной иммунизации антитела не образуются, донора от иммунизации отстраняют. После выработки у донора активных антител, для сохранения и дальнейшего повышения их титра, им необходимо периодически проводить инъекции антигена - реиммунизацию. ^ Реиммунизация проводится лицам, у которых выработались антитела - D вследствие проведенной иммунизации, бывших ранее беременностей или переливания крови. Реиммунизация дает возможность сохранить титр антител в крови иммунизируемых лиц или добиться его повышения. Подбор крови-антигена для реиммунизации проводится так же, как и для иммунизации. Реиммунизация проводится через четыре месяца после окончания иммунизации и появления антител и затем повторяется каждые четыре месяца. У лиц, иммунизированных беременностями или трансфузиями крови, реиммунизацию можно начать также не ранее, чем через четыре месяца, но только вне периода беременности и лактации. Курс реиммунизации состоит из двух-трехкратного внутривенного или внутримышечного введения крови донора по 2-3 мл с интервалом два-три дня. Такие курсы повторяются каждые четыре месяца. ^ Время появления неполных резус-антител анти-D колеблется от четырех месяцев до года и более лет от начала иммунизации. Титр антител может быть от 1:2 до1:1024 и выше. Стойкие высокие титры анти-D у ранее не сенсибилизированных лиц обычно устанавливается не ранее, чем через полтора года. Приведенные схемы иммунизации и реиммунизации обеспечивают выработку неполных антител анти-D с титром не ниже 1:64 не менее чем у 70% иммунизируемых лиц. ^ Для получения антител анти-С и анти-Е рекомендуются следующие сочетания фенотипа крови иммунизируемого лица и эритроцитов, применяемых для иммунизации.
Для получения антител анти-С и анти-Е рекомендуется две схемы иммунизации, из которых первая дает более благоприятный результат. ^ Первый курс состоит из десяти внутривенных введений крови донора антигена с перерывом по два дня. Первыя пять инъекций - по 2 мл и последующие пять - по 1 мл. Затем следует перерыв в четыре месяца. Второй курс состоит из десяти внутривенных или внутримышечных введений крови с интервалами по два дня. Первые пять инъекций - по 1 мл и последующие пять - по 0,5 мл. Третий и дальнейшие курсы. Если по окончании второго курса у донора не выработались антитела, выработались антитела с низким титром или титр их впоследствии ослабел, то через четыре месяца проводят третий курс иммунизации (реиммунизации), аналогичный второму и так повторяется каждые четыре месяца. ^ Первый курс состоит из шести внутривенных или внутримышечных инъекций крови с интервалом по два-три дня. Первая инъекция - 10 мл и последующие пять - по 5 мл. Через восемь-десять месяцев проводится второй курс. Второй курс состоит из трех внутривенных или внутримышечных инъекций крови по 5 мл с интервалом по три-четыре дня. Третий и дальнейшие курсы. Если по окончании второго курса у донора не выработались антитела, выработались антитела с низким титром или титр их впоследствии ослабел, то через четыре месяца проводят третий курс иммунизации (реиммунизации), аналогичный второму и так повторяется каждые четыре месяца. ^ Антитела анти-С и анти-Е появляются в сроки от 6 месяцев (полные) до 2,5-3 лет (неполные) после начала иммунизации. Антитела появляются у 10-15 % иммунизируемых лиц с титром 1:1 - 1:8 для неполных антител и 1:2 - 1:32 - для полных антител. 9. Заключение Иммунизация и реиммунизация не оказывают отрицательного влияния на состояние здоровья доноров. В процессе иммунизации, а также после выработки антител при взятии крови и плазмы (плазмаферез) у доноров согут наблюдаться приходящие изменения периферической крови, например, увеличение количества палочкоядерных нейтрофилов до 10%, моноцитов до 12%, лимфоцитов до 45%, повышение содержания общего количества лейкоцитов до 10х10(9)/л, общего билирубина до 20,5 мкмоль/л, активности аланинаминотрансферазы до 1,36 мкмолей, пировиноградной кислоты на 1 мл сыворотки за 1 час инкубации при 37°С. Эти сдвиги не являются противопоказаниями для продолжения иммунизации и реиммунизации и взятия у доноров крови и плазмы (плазмаферез). Определение антител в сыворотке крови иммунизированных лиц, обработка сывороток и их испытание производится согласно действующей "Инструкции по изготовлению сывороток антирезус". Оплата изоиммунным донорам за каждую иммунизацию производится по отдельному расчету согласно нормативным документам Министерства здравоохранения и органов управления здравоохранения субъектов Российской Федерации. Оплата изоиммунным донорам за дачу крови и плазмы (плазмаферез) производится в двукратном размере по отношению к неиммунным донорам крови, плазмы, согласно нормативным документам Министерства здравоохранения и органов управления здравоохранения субъектов Российской Федерации. С целью увеличения количества изоиммунных доноров крови, плазмы разрешается дополнительная оплата изоиммунным донорам за дачу крови или плазмы на усмотрение органов управления здравоохранения субъектов Российской Федерации. Изоиммунные доноры имеют право на внеочередное обслуживание в лечебных учреждениях. Приложение 17 УТВЕРЖДЕНО Приказ Минздрава России от 09.01 1998г. № 2 ^ 1. Каждое учреждение службы крови, а также лаборатории в других лечебно-профилактических учреждениях, где производится определение резус-принадлжености и изготовление сывороток антирезус и других антисывороток должны иметь постоянных доноров, у которых берется кровь для приготовления стандартных эритроцитов. Станадртные эритроциты применяют в обязательном порядке при определении группы крови АВ0, резус-принадлежногсти, выявлении антиэритроцитарных антител, а также как контроль при изготовлении стнадартных сывороток, предназначенных для определения группы крови АВ0, сывороток антирезус, оазличных тест-сывороток для выявления антигенов эритроцитов. 1.1. при определении группы крови необходимо иметь контрольные эритроциты трех групп: 0, А (подгруппа А1) и В. 1.2. при приготовлении стандартных изогемагглютинирующих сывороток следует использовать кровь доноров указанных в пункте 1.1, и дополнительно иметь доноров подгруппы А2, Ах, А2В, АВ2. 1.3. при определении резус-принадлежности необходимы контрольные резус-положительные и резус-отрицательные эритроциты. 1.4. при изготовлении стандартных сывороток антирезус и при выявлении резус-антител необходимо иметь контрольные эритроциты доноров, указанных в пункте 1.1. и дополнительно подобрать доноров групп 0, А, В, АВ так, чтобы среди образцов крови было по одному резус-положительному и одному резус-отрицательному образцу. Эти доноры должны быть исследованы дополнительно и, в зависимости от наличия у них различных антигенов резус, число доноров должно быть пополнено за счет доноров группы 0(I) так, чтобы в эритроцитах доноров этой группы обязательно имелись антигены резус D, C, E, c, e, Cw порознь или в различных сочетаниях, а также антигены систем K - k, Fya, Fyb и других систем эритроцитов. 1.5. при изготовлении тест-сывороток различной специфичности необходимо иметь контрольные эритроциты доноров, указанных в рунктах 1.3. и 1.4. и типированных по антигенам различных эритроцитарных систем: гомозиготные, гетерозиготные и отрицательные по различным антигенам. 2. Кровь для приготовления стандартных эритроцитов берут у доноров из пальца или из вены не чаще трех раз в неделю в зависимости от потребности. 3. Каждый донор, у которого берут кровь малыми дозами для приготовления стандартных эритроцитов, должен находиться на учете отделения донорских кадров, где на него должен быть заведен донорский журнал. Если лаборатория, для которой донор дает кровь малыми дозами, не входит в состав учрежедения службы крови, донор находится на учете непосредственно в этой лаборатории. При зачислении в доноры (в дальнейшем каждые четыре месяца) донор должен быть осмотрен врачом-терапевтом, у него проверяется содержание гемоглобина и число эритроцитов. Взятие крови допускается при условии содеражания гемоглобина не ниже 12 г/% (120 г/л) для женщин и 13 г/% (130 г/л) - для мужчин. 4. В лабораториях, где у доноров берут кровь для приготовления стандартных эритроцитов, должны быть заведена книга учета взятия крови по следующей форме: Фамилия _____________имя ______________отчество___________ Группа крови ___________________________ фенотип по различным системам эритроцитов _________________
5. Взятие крови количественно подытоживается за 1,5-2 месяца. Итог подписывается руководителем учрежедения или отдела, для нужд которого бралась кровь. 6. Руководитель лаборатории или отдела на основании записи в книге учета взятия крови дает донору справку, в которой должен указать количество взятой крови и за какой период времени взята кровь. Справку подписывает руководитель лаборатории или отдела. 7. Принимая во внимание многократность и характер процедуры взятия крови у донров, компенсацию за взятую кровь устанавилвают в тройном размере по сравнению с суммой компенсации, установленной для доноров, дающих кровь для переливания больным. 8. На доноров, у которых берут кровь малыми дозами для приготовления стандартных эритроцитов, распространяются все льготы, как для доноров дающих кровь для переливания больным, согласно нормативным документам Министерства здравоохранения и органов управления здравоохранения субъектов Российской Федерации. Выходной день предоставляется донору за суммарное взятие крови в количестве не менее 100 мл. Приложение 18 УТВЕРЖДЕНО Приказ Минздрава России от 09.01 1998г. №2 ^ I. Ведение Антитела системы АВО - a и b являются нормальными (естественными) у человека. Они относятся к полным антителам - агглютининам, хорошо реагируют в солевой среде, лучше выявляются при комнтаной температуре и хуже при температуре 37°С. Добавление в реакцию коллоидных веществ не усиливает активности этих антител, непрямой пробой Кумбса их не выявляют. Нормальные антитела a и b легко абсорбируются из сыворотки при добавлении групповой субстанции Витебского. Они чувствительны к воздействию высокой температуры: прогревания при 70°С в течение десяти минут достаточно, чтобы эти антитела полностью потеряли активность. Кроме нормальных (естественных) антитела a и b у человека могут появиться еще иммунные антитела этой системы, которые в отличие от нормальных были обозначены символами анти-А и анти-В. Иммунные антитела не присутствуют регулярно в крови людей, но могут возникнуть вследствие изоиммунизации при парентеральном поступлении в организм несовместимого в групповом отношении антигена, при иногруппной беременности, при ошибочном переливании крови, несовместимой по системе АВО,а также при проведении некоторых прививок и иммунизации. При иногруппной беременности, послужившей причиной гемолитической болезни плода, иммунные антитела анти-А и анти-В почти всегда присутствуют в крови матери к моменту рождения больного ребенка. При этом, им обычно сопутствует высокий титр нормальных антител a и b. При ошибочном переливании несовместимой крови иммунные антитела анти-А или анти-В появляются обычно на пятый-седьмой день, достигая максимума к пятнадцатому-двадцать пятому днь с последующим падением их титра. В крови у таких больных одновременно повышается титр нормальных антител a и b на 3-8 ступеней также с последующим снижением после 25-30 дня. Иммунные антитела анти-А и анти-В могут бвть как в полной так и неполной форме. Они активны при 37°С, могут иметь несколько более высокий титр при проведении реакции в коллоидной среде по сравнению с солевой и выявляются в непрямой пробе Кумбса. Иммунные антитела не абсорбируются при добавлении групповоспецифической субстанции Витебского. Они стойки к температурному воздействю и сохраняют активность при прогревании сыворотки в течение 10 минут при температуре 70°С, т.е. при условиях, которых нормальные антитела a и b полностью инактивируются. Выявление изоиммунных антител может служить ценным диагностическим признаком, в частности, при решении вопроса о причинах гемотрансфузионных осложнений и гемолитической болезни новорожденных. Эти исследования рекомендуются для использования в практике. Наиболее демонстративным отличием нормальных антитела a и b от иммунных антител анти-А и анти-В является их поведение при воздействии высокой температуры. На этих различиях и основано применение разных методов для выявления нормальных антител a и b и изоиммунных антител анти-А и анти-В (см. разделы (II-V). Активность иммунных антитела проявляется в виде способности вызывать агглютинацию эритроцитов при проведении реакции в солевой среде или, как конечный результат, в непрямой пробе Кумбса. Кроме этих антител, вследствие иммунизации, вызванной теми же причинами, могут одновременно образоваться гемолизины, которым свойственна также групповая специфичность (Методы определения групповых гемолизинов см. в разделах II, VI). ^ При определении антител a, b и иммунных антител анти-А и анти-В необходимо следующее оснащение: - стандартные эритроциты группы A(II) и B(III) или смесь эритроцитов от 5-6 доноров отдельно каждой группы; - стандартная сыворотка для пробы Кумбса; - изотонический раствор NaCl; - пробирки центрифужные; - пробирки маленькие высотой 2-2,5 см с внутренним диаметром 5-6 мм и с гладким дном округлой формы; - пробирки высотой 4-10 см для пробы Кумбса; - белые пластинки со смачиваемой поверхностью; - штативы; - термостат 37°С; - центрифуга; - водяная баня 70°С. ^ 1. Подготовительная работв. Станадартные эритроциты или смеси эритроцитов группы A(II) и B(III) дважды отмывают изотоническим раствором NaCl путем центрифугирования, после чего на дне пробирки остается эритроцитная масса, из которой приготавливают 2-3% взвесь и отдельно каждой группы. Исследуемую сыворотку в количестве 0,5-1 мл разводят в четыре раза изотоническим раствором NaCl во избежание коагуляции при нагревании, затем разливают поровну в две пробирки, одну из которых прогревают в течение 10 минут при 70°С, точно соблюдая температуру и время. Таким образом, получится две порции сыворотки - нативной и прогретой, каждая из которых разведена 1:4. Определение антител начинается реакцией агглютинации в солевой среде в маленьких пробирках. Если в этом методе полных иммунных антител не обнаружено, исследование далее дополняют непрямой пробой Кумбса. 2. Техника реакции При исследовании сыворотки группы A(II) или B(III) в штатив устанавливают в ряд 12 маленьких пробирок. При исследовании сыворотки группы 0(I) - два ряда по 12 пробирок. Штатив предварительно накрывают белым листом бумаги, в котором накалывают отверстия для установки пробирок. На бумаге надписывают фамилию и группу крови лица, чья сыворотка исследуется, группу крови стандартных эритроцитов и у каждой пробирки - степень разведения помещенной в нее сыворотки (1:4, 1:8, 1:16 и т.д. до 1:8000). Во все пробирки каждого ряда, начиная со второй, накапывают по две капли изотонического раствора NaCl. Затем в первую и во вторую пробирки (каждого ряда) накапывают по две капли приготовленной непрогретой сыворотки, разведенной в четыре раза. Во второй пробирке каждого ряда сыворотку смешивают с изотоническим раствором NaCl и две капди этой смеси переносят в третью пробирку, из третьей, также после перемешивания - в четвертую и т.д. до последней, из которой две капли удаляют. В результате в пробирках получается разведение сыворотки от 1:4 до 1:8000. В другом штативе также приготавливают разведения предварительно прогретой сыворотки (при этом в штатив обычно достаточно поместить по шесть пробирок - разведение сыворотки от 1:4 до 1:128). После приготовления разведений сыворотки во все пробирки добавляют по одной капле 2-3% взвеси стандартных эритроцитов противоположной группы: при исследовании сыворотки группы B(III) - эритроциты группы A(II), при исследовании сыворотки группы A(II) - эритроциты группы B(III) и при исследовании сыворотки группы 0(I) в один ряд пробирок добавляют эритроциты группы A(II), в другой ряд - эритроциты группы B(III). Содержимое пробирок тщательно перемешивают, после чего штативы оставляют в покое на 1 час: с нативной сывороткой при комнатной температуре, с прогретой - при 37°С. 3. Трактовка результатов Результат оценвют по форме осадка эритроцитов на дне пробирки, просматривая его через лупу с 6-8-кратным увеличением над источником света. При наличии агглютинации осадок располагается в виде комочков неравномерным слоем с изогнутыми, иногда завернутыми внутрь краями. При отсутствии агглютинации осадок эритроцитов располагается равномерным слоем в центре дна пробирки в виде правильно очерченного круга. Результаты отмечают на бумаге у каждой пробирки знаком плюс (+) или минус (-). Наличие агглютинации свидетельствует о присутствии полных антител, а последнее разведение, в котором оно наблюдается - об их титре. Титр антител нативной (непрогретой) сыворотки относится к агглютининам a (или b), титр антител в прогретой сыворотке - к иммунным антителам анти-А (или анти-В). В том случае, если агглютинация наблюдается во всех пробирках, следует повторить исследование, продолжив разведение сыворотки. Отрицательный результат во всех пробирках с прогретой сывороткой говорит об отсутствии иммунных антител полной формы. ^ 1. Подготовительная работа. Стандартные эритроциты или смеси эритроцитов группы A(II) B(III) дважды отмывают изотоническим раствором NaCl, после чего на дне пробирок остаются эритроциты, которые используют для исследования. 2. Техника реакции При исследовании сыворотки группы A(II) или B(III) в штатив устанавливают 6 пробирок, при исследовании сыворотки группы 0(I) - два ряда по 6 пробирок. Пробирки нумеруют. Штатив предварительно накрывают белой листом бумаги, в котором накалывают отверстия для установки пробирок. На бумаге делают обозначения, указав у каждой пробирки ее номер и все другие сведения, как сказано выше для реакции в солевой агглютинации. Во все пробирки, начиная с №2, гакапывают по три капли изотонического раствора NaCl, а затем в пробирки №1 и №2 - по три капли исследуемой, предварительно прогретой сыворотки и далее приготавливают ее разведения, как это указано выше для метода солевой агглютинации, но в объеме трех капель. Во все пробирки пастеровской пипеткой добавляют по одной маленькой капле (0,01 мл) эритроцитов противоположной группы, смешивают сыворотку с эритроцитами и штатив помещают для инкубации в термостат на 45 минут при 37°С. За это время иммунные антитела, если они есть в сыворотке, фиксируются на эритроцитах. После инкубации отмывают эритроциты, для чего в пробирки доливают изотонический раствор NaCl ,перемешивают их содержимое и центрифугируют. Надосадочную жидкость удаляют. Такое отмывание повторяют три раза. После отмывания в каждую пробирку добавляют по 3-5 капель изотонического раствора NаCl для получения приблизительно 5% взвеси эритроцитов и из каждой пробирки по одной капле такой взвеси переносят на белую пластинку со смачиваемой поверхностью, пронумеровав предварительно места на плстинке соответственно номерам пробирок. К каждой капле прибавляют по одной капле сыворотки для пробы Кумбса и перемешивают их стеклянной палочкой. Далее в течение 10 минут наблюдают результат при периодическом покачивании пластинки. Результат оценивают по наличию или отсутствию агглютинации, видимой простым глазом на белом фоне пластинки. Наступление агглютинации обозначают на бумаге у каждой пробирки знаком плюс (+) с указанием времени ее появления в секундах и минутах. Отсутствие агглютинации обозначают знаком минус(-). Наличие агглютинации свидетельствует о присутствии иммунных антител анти-А или анти-В неполной формы, а последнее разведение, в котором оно наблюдается - об их титре*. В том случае, если агглютинация наблюдается во всех пробирках, следует повторить исследование, продолжив разведение сыворотки. Отрицательный результат во всех пробирках свидетельствует об отсутствии иммунных антител неполной формы в данной порции исследуемой сыворотки. * Контроль в отношении возможного ложно-положительного результат за счет активных полных антител не требуется, тк. в данном случае непрямая проба Кумбса ставится как дополнение только при отрицательном результате в солевой среде. 3. Трактовка результатов В ходе вышеописанного исследования определяются три вида антител: - нормальные полные антитела - агглютинины a и b (термолабильные); - иммунные полные антитела анти-А и анти-В (термостабильные); - иммунные неполные антитела анти-А и анти-В (термостабильные). Общее заключение делается на основании сопоставления результатов всех исследований: а) наличие иммунных (термостабильных) антител полной или неполной формы свидетельствует об имевшем место поступлении в организм человека антигена, несовместных полных (термостабильных) антител a и b и редко превышает такие показатели, как 1:8 - для иммунных полных антител и 1:32 - для иммунных неполных антител; б) высокий титр нормальных полных антител - агглютининов a и b (a выше, чем 1:256 и b выше, чем 1:128 при данном методе исследования) даже при отсуствии иммунных термостабильных антител в момент исследования, отражает состояние повышенной менсибилизации организма и позволяет сделать предположение о бывшем в предшествующее время поступлении антигена, несовместимого по системе АВО. в) отсутствие иммунных термостабильных антител анти-А и анти-В при титре нормальных антител a не выше, чем 1:256 и b не выше, чем 1:128 (при данном методе исследования) говорит об отсутствии у человека изоиммунизации групповыми факторами системы АВО к моменту данного исследования. |
||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям