Механизмы нарушения цитокинопосредованной регуляции апоптоза эозинофилов при больших эозинофилиях крови
|
|
Скачать 1.52 Mb.
|
|
^
У пациентов с заболеваниями, сопровождающимися выраженной эозинофилией крови, и у здоровых доноров проводили исследование особенностей реализации программированной гибели эозинофилов in vitro в интактной культуре и в условиях инкубации с рекомбинантными формами цитокинов (IL-5, IL-3, eotaxin); исследование концентрации ключевых цитокинов, регулирующих процессы пролиферации, дифференцировки и активации эозинофилов, в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов (IL-5, IL-3) и сыворотке крови (eotaxin). Распределение здоровых доноров и обследованных пациентов по группам в соответствии с использованными методами исследования представлено в таблице 3. ^ Общее количество лейкоцитов, относительное содержание эозинофилов и лимфоцитов подсчитывали в мазках крови, приготовленных стандартным гематологическим методом [Меньшиков В.В., 1987]. Абсолютное количество эозинофилов рассчитывали из общего содержания лейкоцитов, которое определяли пробирочным способом [Меньшиков В.В., 1987]. ^ Принцип метода заключается в оседании эозинофилов в соответствии с их плотностью в определенном градиенте. Использовали пятиступенчатый градиент Percoll («Amersham Biosciences AB», Швеция) 1,070, 1,081, 1,090, 1,095, 1,105[Gartner I., 1980]. Приготовление градиента различной плотности проводили по формуле: X = V × P - 0,106 - 0,9 / P0 - 0,13, где Х - требуемое количество Percoll (мл), V – требуемое количество раствора (10 мл), Р – требуемая плотность раствора, Р0 – исходная плотность раствора (1,133 г/л). Таблица 3 Распределение здоровых доноров и пациентов с заболеваниями, ассоциированными с эозинофилией крови, в соответствии с использованными методами исследования
Венозную гепаринизированную кровь (25 ЕД/мл) в количестве 10-20 мл осаждали раствором декстрана (в 0,9% NaCl) в соотношении 1:4 с целью удаления эритроцитов. Полученную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 45-60 мин. Надосадок удаляли и центрифугировали при 1500 об/мин 3 мин. Полученный супернатант в объеме 1 мл наслаивали на градиент плотности Percoll и центрифугировали при 4000 об/мин в течение 20 мин. Полученные эозинофильные кольца собирали пастеровской пипеткой с раздела фаз и дважды отмывали раствором Хенкса (или 0,9% NaCl), последовательно ресуспендируя и центрифугируя в течение 10 мин при 1500 об/мин. Из осадка клеток, полученного с каждого градиента Percoll, готовили мазки и окрашивали азурII-эозином с последующим подсчетом 100 клеток и определением относительного содержания эозинофилов. Подсчет количества эозинофилов проводили общепринятыми гематологическими методами [Меньшиков В.В., 1987]. ^ Выделенные эозинофилы крови (2·105 в лунке) культивировали в 96-луночных иммунологических планшетах в полной питательной среде, состоящей из 90% RPMI-1640, 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 0,3 мг/мл L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина и 2мМ/мл HEPES («Flow», GB), в течение 18 ч при температуре 37ºC и 5% СО2. ^ Регистрация апоптоза была основана на определении экспрессии на поверхности клеток фосфатидилсерина. Для его обнаружения использовался FITC-меченный аннексин V, который обладает сродством к фосфатидилсерину. После выделения и культивирования эозинофилов описанным выше способом клетки суспензировали (1∙106 в 1 мл) в аннексиновом буфере, содержащем аннексин V, меченный FITC, и через 15 мин подвергали проточной цитофлуориметрии. Анализ образцов клеточных суспензий проводили на проточном цитометре Epics XL («Beckman Coulter», Франция) с аргоновым лазером. Оценивали следующие параметры: малое угловое светорассеяние (FSC), характеризующее размер клетки, боковое светорассеяние (SSC), характеризующее цитоплазматические, а также мембранные особенности клетки, показатель зеленой флуоресценции (FITC – 530 нм) в гейте эозинофильных клеток, выявляемого на FL1-канале. Использовали автоматическое программное обеспечение и методы сбора и анализа данных с высоким разрешением (1024 канала). ^ В ряде случаев программа апоптоза реализуется при лишении клеток необходимых для них факторов выживания. Эффект ростовых факторов обусловлен их действием на специфические рецепторы, что приводит к синтезу подавляющих апоптоз агентов и ингибированию стимуляторов апоптоза. Уровень экспрессии данных рецепторов, то есть функциональное состояние клеток, зачастую определяет их реакцию на воздействие внешних стимулов или отсутствие таковых [Самуилов В.И., 2000]. Выделенные эозинофилы крови культивировали в 96-луночных круглодонных планшетах. В лунки вносили суспензию клеток (1·105 на лунку), а также чистую среду RPMI-1640 без эмбриональной телячьей сыворотки, то есть в отсутствии ростовых факторов. Клетки инкубировали в течение 18 ч при температуре 37ºС и 5% СО2. Регистрацию апоптоза осуществляли в аннексиновом тесте с помощью проточной лазерной цитофлуориметрии как описано выше (п. 2.2.4.1.). ^ После выделения и культивирования эозинофилов описанным выше способом в отдельные пробы добавляли 10-8 г/мл рекомбинантного (r) IL-3 (r-IL-3) («Biosource», Бельгия), 10-8 г/мл r-IL-5 («Biosource», Бельгия), 10-8 г/мл r-eotaxin («Biosource», Бельгия). После отмывки фосфатно-солевым буфером (рН=7,4) клетки (106 в 1 мл) окрашивали в буфере («Caltag», США), содержащем аннексин V - FITC. Регистрацию апоптоза осуществляли в аннексиновом тесте с помощью проточной лазерной цитофлуориметрии (п. 2.2.4.1.). |
|||||||||||||||||||||||
отлично
1
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям