Механизмы нарушения цитокинопосредованной регуляции апоптоза эозинофилов при больших эозинофилиях крови
|
|
Скачать 1.52 Mb.
|
|
^
Выделение мононуклеарных лейкоцитов крови основано на разделении популяций клеток крови в градиенте плотности. В качестве градиента плотности использовали Ficoll-Paque («Pharmacia», Швеция). Венозную гепаринизированную кровь (25 ЕД/мл) выдерживали при 370С в течение 40-60 мин для отделения плазмы и эритроцитов. Полученную плазму наслаивали на градиент (1,077 г/см³) в соотношении 1:1 и центрифугировали при 1500 об/мин 20 мин. Образовавшееся кольцо из смеси мононуклеарных клеток собирали пастеровской пипеткой с раздела фаз. Трижды отмывали средой RPMI-1640, последовательно ресуспендируя и центрифугируя каждый раз в течение 10 мин при 1500 об/мин [Тотолян А.А. и соавт., 2002]. ^ Для получения супернатантов выделенные мононуклеарные лейкоциты ресуспендировали в полной питательной среде, состоящей из 90% RPMI-1640 («Вектор-Бест», Новосибирск), 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки («Биолот», Санкт-Петербург), 0,3 мг/мл L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина. Стандартизировали количество клеток в суспензии до концентрации 2,0106/мл. Для стимуляции секреторной способности мононуклеаров в пробы вносили 10 мкг/мл фитогемагглютинина (ФГА) («Difco», Германия). Клеточные суспензии в количестве 1,5 мл инкубировали при 37 0С и 5% СО2 на протяжении 18 ч. После инкубации пробирки встряхивали, центрифугировали 10 мин при 1500 об/мин, супернатанты собирали и использовали для количественного определения уровней цитокинов [Хаитов Р.М. и соавт., 1995]. ^ Для определения уровней IL-3 и IL-5 в супернатантах интактной и ФГА-стимулированной культур мононуклеарных лейкоцитов и eotaxin в сыворотке крови использовали твердофазный иммуноферментный «сэндвичевый» метод (ELISA). Процедуру выполнения иммуноферментного анализа проводили согласно инструкциям, предлагаемым производителями тест-систем («Procon», Россия; «Biosource», Бельгия). Для исследования содержания IL-3 и IL-5 в соответствующие ячейки планшета добавляли по 100 мкл «0 дозы» и стандартов с известными концентрациями для IL-3 и IL-5. В оставшиеся ячейки помещали по 100 мкл супернатанта и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. После четырехкратного цикла промывки в лунки микропланшета добавляли по 100 мкл раствора биотинилированных антител и вновь проводили инкубацию при комнатной температуре в течение 1 ч (для определения IL-3) или 30 мин (для определения IL-5). После четырех циклов промывки в каждую лунку вносили по 100 мкл раствора конъюгата стрептавидин-пероксидазы и оставляли на 30 мин при комнатной температуре. По окончании инкубации проводили четырехкратную промывку микропланшетов и в каждую ячейку добавляли по 100 мкл раствора хромогена. Через 30 мин инкубации в затемненном месте при температуре 20-250С в лунки вносили по 100 мкл стоп-реагента (0,5М серная кислота). Для оценки уровня eotaxin микропипеткой добавляли по 50 мкл «0 дозы» и стандартов с известной концентрацией для eotaxin в соответствующие ячейки микропланшета, предварительно внеся во все лунки по 50 мкл буфера для инкубации. В остальные лунки помещали сыворотку в объеме 50 мкл и раствор биотинилированных антител по 100 мкл. Проводили инкубацию при комнатной температуре в течение 2 ч. После четырех циклов промывки в каждую ячейку добавляли по 100 мкл раствора конъюгата стрептавидин-пероксидазы и инкубировали 30 мин при комнатной температуре. После четырехкратного цикла промывки в лунки микропланшета вносили по 100 мкл раствора хромогена и инкубировали в темном месте при комнатной температуре 30 мин. По окончании завершающей фазы инкубации в ячейки вносили по 100 мкл стоп-раствора. Учет результатов иммуноферментного анализа производили с использованием фотометра для микропланшетов «Multiscan EX» («ThermoLabSystems», Финляндия) при длине волны 450 нм. Концентрацию цитокинов вычисляли по калибровочной кривой и выражали в пг/мл. ^ Оценку полученных результатов проводили методами статистического описания и проверки статистических гипотез. При анализе имеющихся выборок данных использовали гипотезу нормальности распределения (критерий Shapiro-Wilk’s). Для нормально распределенных выборок вычисляли средневыборочные характеристики: среднее арифметическое (Х), среднее квадратичное отклонение (σ), ошибка среднего (m). Для выборок, распределение которых отличалось от нормального, рассчитывали медиану (М), первый и третий квартили (Q1, Q3). При соответствии нормальному закону распределения признака в исследуемых выборках проверку гипотезы о равенстве средних выборочных величин проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа. Для оценки достоверности различий выборок, не подчиняющихся критерию нормального распределения, использовали критерий Kruskal-Wallis. С целью попарного сравнения показателей в исследуемых группах применяли критерий Mann-Whitney для независимых групп. Различие двух сравниваемых величин считали достоверным при уровне значимости р<0,05. С целью обнаружения связи между исследуемыми показателями проводили корреляционный анализ путем вычисления коэффициента ранговой корреляции Спирмена (r). Методом множественной регрессии были рассчитаны коэффициенты β, определяющие степень зависимости между исследованными показателями [Гланц С., 1998; Боровиков В.П., 2001]. ^ 3.1. Количественные показатели лейкоцитарного звена крови у пациентов с заболеваниями, ассоциированными с эозинофилией кровиПри изучении количественных показателей лейкоцитарного звена крови было установлено, что у здоровых доноров общее количество лейкоцитов составляло (4,850,75) ·109/л, абсолютное содержание эозинофилов - (0,100,01) ·109/л, а относительное было равным 2,180,06% (табл. 4). Таблица 4 Общее количество лейкоцитов и содержание эозинофилов в крови у пациентов с гемобластозами (  ±m)
У лиц, страдающих злокачественными новообразованиями системы крови, сопровождающимися эозинофилией, достоверное повышение (в 1,47 раза) общего количества лейкоцитов отличалось лишь у лиц с лимфогранулематозом (р=0,031); у пациентов с множественной миеломой и неходжкинскими лимфомами значение данного показателя соответствовало таковому в контрольной группе (р=0,055 и р=0,134, соответственно). У всех обследованных нами больных с гемобластозами было выявлено достоверное увеличение абсолютного и относительного содержания эозинофилов по сравнению со значениями у здоровых доноров и у больных группы сравнения (без эозинофилии). Так, у больных лимфогранулематозом абсолютное и относительное количество эозинофилов составляло соответственно (1,950,01)·109/л (р=0,002 и р=0,009) и 25,794,29% (р=0,003 и р=0,012), при множественной миеломе (0,740,01)·109/л (р=0,035 и р=0,029) и 16,862,63% (р=0,014 и р=0,041), при неходжкинских лимфомах (0,690,02)·109/л (р=0,030 и р=0,045) и 15,182,66% (р=0,042 и р=0,031) (табл. 4). Сравнительный анализ полученных данных показал, что абсолютное и относительное содержание эозинофилов в крови в большей степени было увеличено у пациентов с лимфогранулематозом (табл. 4). У больных хроническим описторхозом без эозинофилии общее количество лейкоцитов достоверно превышало (в среднем 1,6 раза) аналогичные показатели нормы (р=0,031) (табл. 5). Относительное и абсолютное содержание эозинофилов крови у данной категории пациентов достоверно не отличались от таковых в группе контроля (р=0,063 и р=0,092, соответственно) (табл. 5). У пациентов как с острым, так и с хроническим описторхозом было выявлено достоверное увеличение (по сравнению с контрольной группой) общего количества лейкоцитов (соответственно в 2,4 и 1,8 раз, р=0,007 и р=0,034) (табл. 5). Таблица 5 Общее количество лейкоцитов и содержание эозинофилов в крови у пациентов с описторхозом ( ±m)
Примечательно, что у всех обследованных лиц с острым описторхозом регистрировалось повышение относительного и абсолютного содержания эозинофилов в крови, превосходя норму соответственно в 20,8 и 45,3 раз (р=0,001 и р<0,001) (табл. 5). При этом у 50% обследованных с острым описторхозом содержание эозинофилов в гемограмме составляло от 15 до 50%; у 45% пациентов свыше 50%, лишь у 5% больных - доля эозинофильных клеток не превышала 15%. У больных хроническим описторхозом, сопровождающимся эозинофилией, регистрировалось достоверное увеличение (по сравнению со здоровыми донорами) относительного и абсолютного содержания эозинофилов в крови в 8,9 и 17,3 раза (р=0,019 и р=0,001, соответственно) (табл. 5). Следует отметить, что у обследованных нами лиц, страдающих хроническим описторхозом, ассоциированным эозинофилией, число эозинофильных лейкоцитов в гемограмме до 15% было отмечено у 70% пациентов; от 15 до 50% - у 30% пациентов. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
отлично
1
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям