Учебно-методическое пособие Составители: Д. А. Васильев, А. А. Щербаков, Л. В. Карпунина С. Н. Золотухин удк 619: 616
|
|
Скачать 3.74 Mb.
|
|
^
Это бактериальные клетки с характерным свойством кислотоустойчивости являются свободноживущими или паразитами позвоночных. Виды данного рода могут быть ошибочно приняты за другие близкие роды. Свойство кислотоустойчивости, обусловленное присутствием восков в клеточных стенках, особенно важно для типирования микобактерий. Эти бактерии не обесцвечиваются под действием подкисленного спирта или сильных неорганических кислот после окрашивания. Некоторые другие бактерии частично кислотоустойчивы, они легко обесцвечиваются спиртом, но могут быть устойчивы к действию слабой кислоты. В состав рода Mycobacterium включены кислото- и спиртоустойчивые (признак особенно выражен у паразитических видов) аэробные неподвижные грамположительные прямые или изогнутые палочковидные бактерии. Иногда они образуют нитевидные или мицелиальные структуры, фрагментирующиеся при легком механическом воздействии на палочки или кокковидные элементы. Характерно высокое содержание липидов и восков (до 60%) в клеточных стенках, образованных пептидогликано-арабиногалактановым комплексом; некоторые виды образуют каротиноидные недиффундирующие пигменты. Каталазо- и арилсульфатазоположительны; резистентны к действию лизоцима. Растут медленно или очень медленно, видимые колонии появляются через 2-60 суток при оптимальной температуре. Колонии часто розовые, оранжевые или желтые, особенно при росте на свету. Пигмент не диффундирующий, поверхность колоний обычно матовая или шероховатая (сапрофитные виды растут несколько быстрее). Характерные биохимические признаки медленнорастущих патогенных микобактерий представлены в табл. 23. Микобактерии широко распространены в окружающей среде — воде, почве, на растениях и животных. Несмотря на то, что в настоящее время идентифицировано около 50 видов, некоторые авторы считают, что род насчитывает около 200 паразитических и сапрофитных видов; типовой вид — Mycobacterium tuberculosis. По признаку патогенности выделяют собственно патогенные, вызывающие конкретные заболевания, и атипичные микобактерии. Для систематики последних предложены различные классификации, основанные на генетическом сходстве с Mycobacterium tuberculosis или сходстве с сапрофитными видами; среди предложенных вариантов наибольшее распространение нашла классификация Раньона (1959), в основу которой положены два свойства — цвет колоний и скорость роста. Она выделяет 5 групп микобактерий — патогенные (Mycobacterium tuberculosis, M.leprae, M. bovis, M. microti и М. lepraemurium) и 4 группы атипичных микроорганизмов:
Знание микобактерий этих групп необходимо для дифференциации от патогенных микобактерий. Основные микобактерии, патогенные для человека, представлены в табл. 24. Бактериологические методы идентификации различных микобактерий включают определение следующих параметров: способность к образованию пигмента, скорость роста, рост при разных температурах (табл. 25), способность к росту на МПА, формы колоний и микроколоний, толерантность к NaCI и некоторые биохимические особенности. Mycobacterium tuberculosis (палочка Kоxa). Возбудитель туберкулеза человека — хронического инфекционного заболевания, характеризующегося поражениями органов дыхания, костей, суставов, кожи, мочеполовых и некоторых других органов. Заболевание известно с глубокой древности. Легочная форма туберкулеза описана античными авторами (Аретеем Каппадокийским, Гиппократом и др.). Однако древние авторы не рассматривали его как инфекцию, а Ибн-Сина вообще считал его наследственной болезнью. Первым прямо указал на его инфекционную природу Фракасторо, а Сильвий отметил связь легочных бугорков с чахоткой. ^
* комплекс М. bovis включает М. bovis, BCG и М. africanum. ** комплекс М. avium включает М. avium и М. intracellulare. Многообразие клинических проявлений туберкулеза (или, как его называли, чахотки) обусловило много ошибочных представлений; де Лаэннек относил легочные бугорки к злокачественным новообразованиям, и даже великий Вирхов не связывал казеозный некроз с туберкулезным процессом. Рост городов, скученность населения и низкий санитарный уровень жизни привели к тому, что в XVIII-XIX вв. туберкулез собирал обильную жатву среди разных слоев населения: достаточно вспомнить Моцарта, Шопена, Некрасова, Чехова и др. Инфекционная природа заболевания была впервые доказана Вильменом (1865), а важнейшим этапом в изучении и совершенствовании мер борьбы с туберкулезом стало короткое сообщение Коха на заседании Берлинского физиологического общества 24 марта 1882 г. об этиологии туберкулеза, в котором он изложил основные постулаты-критерии для оценки патогенности любого микроорганизма.РаспространениеРезервуар Mycobacterium tuberculosis — больной организм; основной путь заражения — аэрогенный, реже через кожу и слизистые оболочки. В редких случаях возможно трансплацентарное инфицирование плода. Проникновение микобактерий далеко не всегда вызывает развитие патологического процесса; особую роль играют неблагоприятные условия жизни и содержания. ^
ООС — объекты окружающей среды. ^ Тонкие, прямые или слегка изогнутые палочки размерами 1-100,2-0,6 мкм, со слегка закругленными концами; в цитоплазме содержат зернистые образования. Морфология существенно варьирует в зависимости от возраста культуры и условий культивирования — в молодых культурах палочки более длинные, а в старых склонны к простому ветвлению. Иногда образуют кокковидные структуры и L-формы, сохраняющие инфекционность. Неподвижны, спор не образуют, лишены капсул, но имеют микрокапсулу, отделенную от клеточной стенки осмиефобной зоной. Кислотоустойчивы, что обусловлено высоким содержанием липидов (от 30,6% до 38,9%) и миколовой кислоты с длинными цепями атомов углерода (до 80) в клеточной стенке. Образуют кислотолабильные гранулы, преимущественно состоящие из метафосфата (зерна Муха), располагающиеся свободно либо в цитоплазме палочек. Грамположительны, анилиновые красители воспринимают плохо; по Циль-Нильсену окрашиваются в ярко-красный цвет, по Муху-Вайссу — в фиолетовый (йодофильность); гранулы также окрашиваются в соответствующий цвет.^Аэробы, но способны расти в факультативно анаэробных условиях; 5-10% содержание СО2 способствует более быстрому росту. Размножаются делением, процесс проходит очень медленно, в среднем за 14-18 ч. Оптимум температурный — 37-38°С, рН 7,0-7,2 (растет в пределах 4,5-8,0). ^
* Н — нефотохромогенные; С — скотохромогенные; Ф — фотохромогенные. ** Скорость роста на твердых средах: медленная — рост в течение 4-6 недель; умеренная — рост в течение 2-3 недель; быстрая — в течение 5-7 суток. Для роста нуждаются в присутствии белкового субстрата и глицерина, а также углерода, хлора, серы, фосфора, азота, факторов роста (биотина, никотиновой кислоты, рибофлавина и др.), ионов (Mg2+, К+, Na+, Fe2+). Для выращивания наиболее часто используют плотные яичные среды (Левенштайна-Йенсена, Виноградова, Петраньяни, Дорсе и др.), синтетические и полусинтетические жидкие среды (например, среда Сотона) и др. На жидких средах рост наблюдают на 15-17 сутки в виде сухой морщинистой пленки (R-форма) поднимающейся на края пробирки; среда остается прозрачной. В средах, содержащих детертент (твин-80), дают равномерный рост по толще среды (особенно при периодическом встряхивании). На плотных средах рост отмечают на 14-40 сутки в виде, сухого морщинистого налета кремового цвета; колонии с приподнятым центром, напоминающие цветную капусту, крошковатые, плохо смачиваются водой и имеют приятный аромат. Культуры плохо снимаются со среды, а при прокаливании трещат. Под влиянием антибактериальных препаратов могут диссоциировать с образованием мягких влажных S-колоний либо расти в виде гладких или пигментированных колоний. Отличительная особенность Mycobaclerium tuberculosis — способность к синтезу значительного количества никотиновой кислоты, что используют для ее дифференциальной диагностики с прочими микобактериями (ниациновый тест); одно из условий — необходимость посева на среду Левенштайна-Йенсена, не содержащую малахитовый зеленый (т.к. краситель вступает в реакцию с используемыми реагентами). На средах с желчью образуют сероватый маслянистый налет, образованный удлиненными ветвящимися палочками. Палочка Коха достаточно устойчива к различным воздействиям; в молоке погибает через 15-20 минут при температуре 60°С; при аналогичной температуре в мокроте сохраняется до часа; при кипячении погибает через 5 минут. Прямой солнечный свет убивает палочку Коха через 45-55 минут, рассеянный свет — через 8-10 суток. Хорошо сохраняется при высушивании (до нескольких недель). Обычные химические дезинфектанты относительно мало эффективны; 5% раствор фенола убивает Mycobacterium tuberculosis лишь через 5-6 ч; возбудитель также способен быстро вырабатывать устойчивость ко многим антибактериальным средствам. ^ Наиболее часто заражение происходит посредством ингаляции аэрозоля, содержащего микобактерии, либо при употреблении контаминированных продуктов. Ингалированные микобактерии фагоцитируют альвеолярные и легочные макрофаги и транспортируют их в регионарные лимфатические узлы; фагоцитарные реакции носят незавершенный характер, и возбудитель переживает в цитоплазме макрофагов. Способность снижать активность фагоцитов обусловливают сульфатиды (серосодержащие гликолипиды), усиливающие токсическое действие корд-фактора (поражает мембраны митохондрий) и ингибирующие фагосомо-лизосомальное слияние. Воспалительный ответ обычно не выражен, что в значительной степени опосредовано способностью корд-фактора тормозить миграцию полиморфноядерных фагоцитов. Но в месте проникновения может развиться первичный аффект. В динамике по ходу регионарных лимфатических путей и узлов формируется первичный комплекс, характеризующийся развитием гранулем в виде бугорков (отсюда бугорчатка, или туберкулез). Образование гранулем не имеет характерных особенностей и представляет собой клеточную реакцию ГЗТ. Сенсибилизация организма обусловлена действием ряда продуктов микобактерий, известных как старый туберкулин Коха, проявляющих местный и системный эффект. В определенной степени формированию гранулем способствуют образование большого количества молочной кислоты, низкое значение рН и высокая концентрация СО2. Туберкулезная грануляционная ткань содержит также значительное количество лимфоидных и плазматических клеток, а в периферических отделах выявляют фибробласты. В центре каждого бугорка расположен участок творожистого некроза (казеоза), где располагаются палочки Коха. Участок некроза окружен эпителиоидными и гигантскими (многоядерными) клетками Пирогова-Лангханса. Центр окружают эпителиоидные клетки, а по периметру — лимфоциты, плазмоциты и мононуклеары, наиболее часто первичный очаг наблюдают в легких (очаг Гона). В гранулемах размножение возбудителя обычно замедляется или прекращается совсем. Довольно характерен «период латентного микробизма» — состояние, при котором проникшие микобактерии не вызывают развития воспалительных реакций и свободно диссеминируют по организму. В большинстве случаев первичные очаги заживают с полной деградацией содержимого, его кальцификацией и фиброзом паренхимы. Клинические проявления обычно отсутствуют либо напоминают гриппоподобный синдром, иногда первичный очаг или увеличенные бронхолегочные лимфатические узлы можно выявить рентгенологически. Для первичного туберкулеза характерна высокая чувствительность тканей к метаболитам микобактерий, что способствует их сенсибилизации, при заживлении аффекта повышенная чувствительность исчезает и нарастает выраженность иммунных реакций. Однако в этих условиях возможно диссеминирование возбудителя из первичных очагов (особенно лимфатических узлов) и формирование очагов отсевов (послепервичные очаги реинфицирования); обычно они локализованы в легких, почках, половых органах и костях. При ослаблении иммунитета организма очаги активизируются и прогрессируют с развитием вторичного процесса. Определенный вклад в патогенез заболевания вносит сенсибилизация организма, вызывающая разнообразные токсико-аллергические реакции у пациентов. В более редких случаях, у ослабленных организмов, а также у пациентов с иммунодефицитами, наблюдают диссеминированный (милиарный) туберкулез, характеризующийся образованием гранулем в различных органах. Развитие генерализованных поражений наиболее часто происходит после прорыва содержимого гранулемы в кровоток. Общие проявления аналогичны таковым при вторичном туберкулезе, но к ним часто присоединяются поражения мозга и его оболочек, прогноз подобной формы заболевания неблагоприятный. Многообразие форм туберкулезного процесса обусловило сложность его классификации. В настоящее время клиническая классификация выделяет три основные формы.
При постановке клинического диагноза учитывают также локализацию, протяженность и фазу процесса, а также способность к активному выделению микобактерий. ^ Лабораторная диагностика (рис. 21) включает методы, входящие в обязательный диагностический минимум, и дополнительные методы исследования. Первые включают, помимо физикального и рентгенологического исследования, следующие манипуляции. В случае заболевания микроскопия патологического материала (мокрота, отделяемое свищей, моча, промывные воды из бронхов) в мазках, окрашенных по Цилю-Нильсену, может выявить красные кислотоустойчивые палочки, в последние годы в практику внедрен метод Мурахаси-Йошиды (1957), позволяющий дифференцировать мертвые и живые бактерии. Однако бактериоскопический метод наименее чувствителен, т.к. позволяет выявить возбудитель при содержании 100 000-500 000 микобактерий в 1 мл материала. При незначительном содержании возбудителя можно использовать метод накопления по Уленгуту — материал смешивают с равным или двойным объемом смеси NaCI и NaOH, энергично встряхивают и инкубируют 30 минут при температуре 21°С Затем клеточный детрит и посторонние бактерии (в виде супернатанта), разрушившиеся под действием щелочи, удаляют центрифугированием; осадок нейтрализуют 30% раствором уксусной кислоты и готовят мазки, окрашиваемые по Цилю-Нильсену или Киньону. Более эффективен метод флотации — в материал вносят раствор NaOH, дистиллят и ксилол (бензол) и энергично длительно встряхивают, образующаяся пена всплывает и захватывает микобактерий; ее отсасывают и готовят мазки. Определенную ценность в оценке тяжести процесса, эффективности лечения и прогноза заболевания имеет количественная оценка популяции микобактерий методом Гаффки-Стинкена (подсчет бактерий на калиброванных стеклах в определенных полях зрения). Наиболее результативный бактериоскопический метод — люминесцентная микроскопия, т. к. окраска флюорохромом (например, аурамин-родамином) позволяет выявлять даже незначительное количество микобактерий (окрашиваются в бело-желтый цвет), а также формы с измененными культуральными и тинкториальными свойствами. ^ Перед посевом исследуемый материал можно обработать по Уленгуту или Сумиоши (15-20% раствором НСl или H2SO4), исследуемые образцы центрифугируют, отмывают физиологическим раствором и засевают, тщательно втирая, на твердые питательные среды (обычно Левенштайна-Йенсена). Для простоты можно обработать образцы различными антибиотиками, подавляющими рост контаминирующей флоры. Недостаток метода — длительность получения результата от 2 до 12 недель; достоинство — возможность получения чистой культуры, что позволяет ее идентифицировать, оценить вирулентные свойства и определить чувствительность к лекарственным препаратам. Разработаны ускоренные методы выделения возбудителя (например, Прайса): материал помещают на предметное стекло, обрабатывают H2SO4, отмывают физиологическим раствором и вносят в питательную среду, дополненную цитратной кровью. Стекло вынимают через 3-4 суток и окрашивают по Цилю-Нильсену. ^ «Золотой стандарт» в диагностике туберкулеза — биологическая проба на морских свинках, зараженных подкожно или внутрибрюшинно 1 мл материала, полученного от больного. У животных развивается генерализованная инфекция, приводящая к смерти через 1-2 месяца; однако заболевание можно распознать раньше постановкой проб с туберкулином — через 3-4 недели после заражения, а лимфадениты обнаруживают уже на 5-10 сутки. Пунктаты последних содержат значительное количество микобактерий. Появление в последние годы резистентных (особенно изониазид-устойчивых) или измененных микобактерий снизило чувствительность биологической пробы. Для ее повышения применяют интратестикулярное заражение либо подавляют иммунитет организма животных введением глюкокортикоидов.  Рисунок 21. Принципиальная схема бактериологического выделения возбудителей туберкулеза ^ Предложено большое количество различных реакций, выявляющих Аг микобактерий и AT к ним, например РСК, РА, РПГА по Бойдену, агрегатагглютинации и др.; однако они либо не обладают необходимой специфичностью, либо требуют дифференциальной диагностики при получении ложноположительных реакций с Аг и AT к другим микобактериям. ^ Имеют особую значимость, т.к. позволяют проводить широкомасштабные скрининговые обследования населения; метод включает внесение небольших доз ППД-Л (новый туберкулин Коха) в кожные насечки (реакция Пирке), внутрикожно (реакция Манту) и подкожно (реакция Коха). При положительном результате через 48 ч (у пожилых лиц — через 72 ч) в месте введения формируется папула диаметром 10 мм с гиперемированными краями. В большинстве стран наиболее распространена проба Манту, т.к. результаты реакции Пирке часто вызывают затруднения при их интерпретации. Положительная реакция Манту указывает на контакт лица с Аг Mycobacterium tuberculosis или других бактерий, дающих перекрестную реакцию; положительный результат нельзя рассматривать как признак активного процесса. При появлении папулы меньших размеров (5-10 мм) результат считают сомнительным, и рекомендовано повторить пробу с введением 10 ЕД. При еще меньших размерах папулы реакцию считают отрицательной; следует помнить, что отрицательная реакция Манту не всегда указывает на отсутствие процесса, т.к. у больных с иммунодефицитами реакция обычно также отрицательна. ^ Включают оценку иммунного статуса пациента, что имеет прогностическое значение, т.к. у больных с дефектами Т-лимфоцитов прогноз хуже. ЛечениеРазработка средств лечения туберкулеза — важная страница в истории бактериологии, ставшей трагедией всей жизни Роберта Коха. В 1890 г. он доложил на Х Международном съезде врачей о терапевтической эффективности экстракта убитых туберкулезных бактерий, названного им туберкулин (старый туберкулин), и опубликовал сообщение в «Deutsche Medizinische Vochenschrift». Значимость открытия была так велика, что автор был награжден орденом Красного Орла (чего не удостаивался ни один медик). Однако широкое применение препарата показало, что он не только не излечивал, но и активизировал латентный процесс, что вызвало бурную критику в прессе. Следует отметить, что и в настоящее время арсенал специфической химиотерапии остается небольшим, особенно учитывая способность микобактерий к развитию резистентности. Противотуберкулезные средства разделяют на препараты первого ряда и альтернативные средства. Первая группа включает изониазид, этамбутол, стрептомицин, пиразинамид, рифампицин: комбинация из двух препаратов обычно позволяет преодолеть химиорезистентность возбудителя. Альтернативные средства — канамицин, циклосерин, парааминосалициловая кислота (ПАСК), этионамид, виомицин, капреомицин и тиоацетазон. Лечение активного туберкулеза требует проведения интенсивной терапии, при положительных результатах выделение возбудителя прекращается в среднем в течение 2-4 недель, и больного можно выписать из стационара, но лечение следует проводить не менее года. ^ Включает соблюдение элементарных правил гигиены, а также проведение специализированных мероприятий по диспансеризации больных лиц и широкомасштабному профилактическому обследованию населения. При положительной кожной пробе и отсутствии признаков активного процесса назначают изониазид курсом до года. Иммунопрофилактика включает внутрикожное введение аттенуированного штамма Mycobacterium bovis (штамм Лейт-Нокар-Альфор), известного как бацилла Кальметта-Герена (БЦЖ). ^ Возбудитель туберкулеза крупного рогатого скота, вызывает 5% случаев туберкулеза у человека. Морфологические отличия от Mycobacterium tuberculosis не выражены, микобактерии бычьего типа несколько короче, с менее выраженной склонностью к ветвлению. Культуральные свойства также сходны; однако на искусственных средах растут медленно и только при температуре 37°С, в глицерине не нуждаются. В первичных культурах и на средах, не содержащих пируват, отмечают скудный рост; колонии мелкие, плоские, шероховатые. Принципы выделения аналогичны таковым для микобактерий человеческого типа (рис. 21). Основными методами дифференциальной диагностики с Mycobacterium tuberculosis считают ниациновый тест и биологическую пробу на кроликах (кролики резистентны к заражению М. tuberculosis). Возбудитель — рекордсмен по числу возможных хозяев и выявлен у 60 видов млекопитающих, но эпидемическую опасность для человека представляют крупный рогатый скот (наибольшее значение), верблюды, козы, овцы, свиньи, собаки и кошки. Больные животные выделяют микобактерии с молоком, мокротой, мочой и калом: человек заражается при контактах с больным животным или при употреблении сырого молока, или (реже) плохо обработанного мяса. В сливочном масле возбудитель может сохраняться до 240 суток, в сыре — до 200 суток. ^ Основной возбудитель туберкулеза в Африке, морфологически и культурально сходен с Mycobacterium bovis; идентифицирован Кастетсом с соавторами (1968-1969) при изучении вспышки туберкулеза в Западной Африке. Истинное распространение возбудителя определить сложно, т. к. во многих лабораториях его не идентифицируют либо путают с М. bovis, во всяком случае, при обследовании более чем 7000 больных туберкулезом в Великобритании выявлено свыше 90 случаев инфицирования М. africanum. ^ Возбудитель туберкулеза птиц. Бактериальные клетки тонкие, от коротких до длинных, иногда ветвятся. Оптимум температуры 38-41°С, рН 6,8-7,3. На питательных средах растет быстрее (10-20 дней), чем М. bovis и M. tuberculosis. На плотных яичных средах растет в виде гладкого маслянистого налета. Колонии округлые, слизистые, мягкие, серовато-белые, с возрастом могут желтеть. Могут иметь пуговицеобразное возвышение с кратерообразным углублением. При первичной изоляции из патологического материала колонии плоские и полупрозрачные. Бактериальная масса легко суспендируется в физиологическом растворе. В жидких питательных средах возбудитель дает диффузный рост, на поверхности формируется влажная жирная пленка, на дне рыхлый осадок. Вид антигенно неоднороден. Дифференцируют три серовара. Серовар 2 отличается большой патогенностью для кур (Molmsky, Schaeter, 1973). Кроме больных птиц, может быть изолирован из лимфатических узлов и пораженных тканей крупного рогатого скота, свиней и других животных. В эксперименте при внутривенном заражении кур обусловливает заболевание с летальным исходом в течение месяца, реже позднее. На вскрытии у павших кур обнаруживают очаги в печени и селезенке. У зараженных внутривенно кроликов развивается септический процесс, и они гибнут на 11-30-е сутки. После подкожного заражения у морских свинок наблюдают изменения (абсцесс) на месте инъекции. В соответствии с «Наставлением по диагностике туберкулеза животных» (1986) бактериологическое исследование предусматривает микроскопическое исследование препаратов, окрашенных по методу Циля-Нельсена, люминесцентную микроскопию, выделение культуры посевом материала на стерильные питательные среды (Петраньяни, Гельберга, Левенштейна-Иенсена). Выделенные культуры идентифицируют с учетом скорости появления первичного роста, культурально-морфологических и тинкториальных свойств, способности к росту при различных температурных режимах (20-25, 37-38, 45°С) на разных питательных средах (яичные, яичные с салицилатом натрия, МПБ). Проводят биопробу с целью обнаружения возбудителя в испытуемом материале или определения видовой принадлежности выделенной культуры микобактерий. Вид подопытного животного определяется целью исследования (морские свинки, куры, кролики). ^ Возбудитель паратуберкулеза. Болеют крупный рогатый скот, овцы, козы и другие виды домашних и диких животных. Клетки палочковидной формы, размером 0,6-2,0 0,2-0,5 мкм, окрашиваются равномерно, однако в удлиненных клетках могут наблюдаться неоднородные по тинкториальным свойствам участки. В старых культурах возможно наличие кокковидных или удлиненных форм. В мазках из патологического материала характерно расположение клеток кучками, в виде «палисада». Культивирование затруднительно. Поэтому в питательные среды добавляют, особенно при первичной изоляции, ростовой фактор — микобактин (0,03 мкг/мл). Остальные микобактерии продуцируют его самостоятельно. Препарат микобактина можно заменить экстрактами из микобактерий других видов, которые вносят в питательную среду в количестве 1-4%. Наибольшее количество ростового фактора содержится в экстрактах из М. phlei (Twort, Ingram, 1913). Аэроб, температурный оптимум 38°С. В жидких питательных средах растет с образованием нежной, беловатой пленки (через 3-4 месяца культивирования становится толще и опускается на дно пробирки). На плотных питательных средах макроскопически видимый рост появляется через 1,5-2 месяца. Колонии сухие, сморщенные, беловато-серого или желтого цвета ^ Изолируют при ограниченных поражениях у свиней, крупного рогатого скота и туберкулезоподобной патологии у людей. Наряду с перечисленными видами в природе обитают микобактерии, не вызывающие патологию у животных, но способные сенсибилизировать организм и обусловливать положительные реакции на туберкулин. К этой группе микобактерии относятся следующие виды: M.xenopi, M.ulcerans, М. haemophilum, М. farcinogenes, М. malmoense, М. asiaticum, М. gordone, М. szulgai, М. shimoidei, М. simiae, М. serofuiaceum, М. microti, М. kansassii, М. nonchromogenicum и др. ^ Среда Петраньяни. В стерильную колбу со стеклянными шариками вносят 250 мл свежего цельного молока, 6 г картофельной муки, 1 г пептона, одну мелко нарезанную картофелину размером с куриное яйцо. Помешивая, выдерживают колбу с содержимым в кипящей водяной бане 10 минут, охлаждают до 60°С и вносят один желток и содержимое 4 свежих куриных яиц, 12 мл стерильного глицерина, 6 мл 2%-ного (на дистиллированной воде) раствора малахитового зеленого. Компоненты перемешивают, фильтруют через двойной слои марли, разливают по стерильным пробиркам и свертывают в наклонном положении в аппарате Коха при 85°С 30 минут. В последующие двое суток прогревают при 75°С по 15 минут. Готовая среда светло-зеленого цвета. Хранят на холоде. ^ Готовят солевой раствор следующего состава. В 600 мл дистиллированной воды растворяют первоначально 2,4 г одноосновного фосфата калия, далее последовательно 0,24 г сульфата магнезии, 0,6 г цитрата магнезии, 3,6 г L-аспарагина, 12 г химически чистого глицерина. Раствор стерилизуют текучим паром 120 минут, добавляют 30 г картофельного крахмала, разливают в колбы по 150 мл и нагревают в кипящей водяной бане до загустения смеси. Затем готовят яичную массу. В литровую стерильную колбу с бусами асептично вносят содержимое 20-22 куриных яиц (свежих), перемешивают, фильтруют через марлю. К 1000 мл яичной смеси добавляют 20 мл стерильного 2%-ного раствора малахитового зеленого и перемешивают. К 1 л яичной смеси с малахитовым зеленым добавляют 600 мл солевого раствора с крахмалом, выдерживают около одного часа до исчезновения пузырьков, асептично разливают по 8-10 мл в пробирки и в скошенном положении в аппарате Коха прогревают при 80-85°С 40 минут. Далее выдерживают в термостате для контроля стерильности. Хранят на холоде. Если среду используют для определения лекарственной устойчивости микроорганизмов, крахмал не добавляют. ^ Пять свежих куриных яиц моют, обтирают спиртом, слегка обжигают, вскрывают. Асептично извлекают два желтка и помещают их в стерильную колбу с бусами, встряхивают. Добавляют 50 мл солевого раствора, 50 мл молока, 50 мл картофельного отвара, 2,5 мл 10%-ного стерильного раствора лимонной кислоты. Компоненты перемешивают, добавляют 3,5 мл 2%-ного раствора малахитового зеленого и вновь содержимое колбы тщательно перемешивают. Смесь фильтруют через стерильную марлю и по 4-6 мл разливают в пробирки. Стерилизуют в аппарате Коха при 85°С 60 минут однократно. Готовую питательную среду для контроля стерильности выдерживают 48 ч в термостате. Используют в течение недели после изготовления при хранении на холоде. ^ Очищенный и нарезанный картофель заливают двойным (по весу) количеством воды, кипятят 15 минут, отстаивают, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают в колбы по 110 мл и стерилизуют при 120°С 20 минут. ^ Снятое коровье молоко разливают по 110 мл в колбы, стерилизуют первый день при 105°С 10 минут и второй — 15 минут текучим паром. 2%-ный раствор малахитового зеленого стерилизуют при 120°С 20 минут. 10 г кристаллической лимонной кислоты растворяют в 100 мл дистиллированной воды, разливают по 10 мл в пробирки и стерилизуют 20 минут при 120°С. ^ Берут К2НРO4 — 1 г, натрия лимоннокислого — 1 г, магнезии сернокислой — 1 г, пептона — 6 г, глицерина химически чистого — 30 мл, воды дистиллированной — до 1000 мл. Каждый компонент растворяют в небольшом количестве воды, потом вносят глицерин и добавляют дистиллированную воду до 1000 мл. Смесь слегка подогревают, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в колбы по 110 мл и стерилизуют 20 минут при 105°С. ^ Белый картофель тщательно моют с мылом, насухо вытирают, очищают, прокаленным ножом срезают оба полюса картофелины. Специальным стерильным бором вырезают из картофеля цилиндры длиной 5—6 см, шириной в соответствии с диаметром пробирки. Цилиндры по диагонали разрезают на два клина и опускают последние в 5%-ную стерильную глицериновую воду на 1-2 ч. Далее клинья подсушивают при помощи стерильной фильтровальной бумаги и пинцетом опускают в пробирки Ру с перетяжкой, содержащие в нижней части 5%-ную стерильную глицериновую воду (рН 7,0-7,2), с расчетом, чтобы нижняя часть картофельного клина касалась жидкости. Пробирки стерилизуют при 110°С 10 минут. Сразу после стерилизации пробирки размещают в наклонном положении поверхностью посевов вниз, что позволяет сохранить их влажными. Стерильность контролируют выдерживанием пробирки в термостате в вертикальном положении двое суток. Хранят на холоде. ^ Приготавливают компоненты. Смешивают 500 г мясного говяжьего фарша с 500 мл 15%-ной глицериновой воды и выдерживают 24 ч на холоде. Перед употреблением фильтруют. Асептически извлекают содержимое куриных яиц, помещают в мерный цилиндр и перемешивают. Далее готовят 1%-ный спиртовой раствор генцианвиолета и выдерживают 24 ч в термостате. Для изготовления среды в 1 часть мясного настоя вносят 2 части яичной смеси и 1 мл раствора генцианвиолета на каждые 100 мл среды. Компоненты тщательно перемешивают, разливают по пробиркам и прогревают первый день при 85°С, а два последующих дня — при 75°С по 45-60 минут. Готовую среду контролируют на стерильность, выдерживая в термостате 3-5 дней. ^ Вымытый, очищенный и нарезанный мелкими кусочками картофель заливают водой (1:2) и варят при 120°С 1,5 ч. Горячий отвар фильтруют через марлю. В фильтрат вносят 1% пептона, 0,5% натрия хлорида, 5% глицерина. Смесь стерилизуют в автоклаве и используют по мере необходимости. При изготовлении среды к 1 части картофельного отвара добавляют 2 части яичной смеси, перемешивают, разливают по пробиркам и прогревают при 90°С. Затем в каждую пробирку вносят 0,5-1,0 мл МПБ с глицерином или картофельного отвара и повторно стерилизуют при 100°С два дня по 45 минут. ^ Вымытые куриные яйца помещают на 10-15 минут в сосуд с этиловым спиртом, затем обжигают на пламени горелки, содержимое асептично переносят в колбу с известным весом и доливают 10% (вес/вес) дистиллированной воды. Смесь тщательно перемешивают, фильтруют через стерильную марлю, разливают по пробиркам и свертывают в наклонном положении при 70-75°С 60 минут. Контролируют на стерильность, выдерживая 3 суток в термостате. Среда Международной лиги борьбы с туберкулезом (MIUT). Среда Левенштейна-Иенсена без крахмала. Пробки в пробирках герметизируют парафином, хранят при 4°С. Среда пригодна для использования в течение полугода. ^ (Zaher, Marks, 1977). В 600 мл дистиллированной воды растворяют 6,3 г КН2РO4, 0,3 г MgSO4 7Н2O, 12 мл глицерина и автоклавируют при 110°С 15 минут. К раствору асептически добавляют 1100 мл полной яичной смеси, 3 мл 1 н НСl, 11 мл раствора малахитового зеленого (2%-ный вес/объем) и 100 000 ЕД натриевой соли пенициллина. Среду разливают по пробиркам, прогревают при 75-85°С 45 минут. ^ Готовится аналогично среде No1а, вместо глицерина добавляют 7 г натрия пирувата. Кислотная яичная среда No2а (Zaher, Marks, 1977). В 600 мл дистиллированной воды растворяют 2,4 г КН2РО4, 0,3 г MgSO4 7H2O, 12 мл глицерина, автоклавируют при 110°С 15 минут. Солевой раствор асептично смешивают с 1000 мл полной яичной смеси, добавляют 40 мл 1 н НСl, 10 мл раствора малахитового зеленого (2%-ный раствор вес/объем) и 100 000 ЕД натриевой соли пенициллина. ^ Готовится аналогично среде No2а, глицерин замещают 7 г натрия пирувата. Кислотные яичные среды предназначены для выделения возбудителя туберкулеза из материалов, подвергнутых обработке различными способами. Для посева высокощелочных инокулятов рекомендуются среды No 1а и 1b, нейтральных и кислых — No 2а и 2b, без добавления НСl (Zaher, Marks, 1977). ^ К МПБ добавляют 5-10% химически чистого глицерина, рН 7,2, стерилизуют при 110°С. На основе глицеринизированного МПБ, добавляя агар-агар, готовят глицериновый МПА. ^ В 940 мл дистиллированной воды растворяют 0,5 г двухосновного фосфорнокислого калия, 0,5 г сернокислой магнезии, 0,05 г лимоннокислого аммиачного железа, 2 г лимонной кислоты, 4 г аспарагина, 60 мл глицерина химически чистого. ^ Непосредственно перед посевом дистиллированной водой 1:2-1:3 разводят стерильную нитратную кровь, разливают по 3 мл в пробирки и вносят раствор пенициллина из расчета 2 ЕД/мл (Тогунова, 1973). ^ Берут 3 г аспарагина, 7 г щавелевокислого аммония, 5 г двухосновного фосфорнокислого калия, 0,5 г сернокислого магния, 0,05 г сернокислого железа, 40 мл глицерина и дистиллированной воды до 1000 мл. Подщелачивают до рН 6,8-7,2, фильтруют через бумажный фильтр и стерилизуют 30 минут при 120°С. ^ Используют для культивирования М. paratuberculosis. На 4%-ном глицериновом бульоне выращивают 10-15 суток культуру М. phlei. Путем фильтрации через бу мл мажный фильтр отделяют бактериальную массу, переносят ее в ступку с 10 мл глицерина и 100 мл печеночного экстракта Дедляу. Смесь несколько минут кипятят, отстаивают и надосадочную жидкость сливают в мерный сосуд, добавляют содержимое трех куриных яиц. Перемешивают и вносят 2,5% (объем/объем) 1%-ного спиртового раствора генцианвиолета. Фильтруют через стерильную марлю, разливают по пробиркам и помещают в аппарат для свертывания. Стерилизуют дробно, первый день при 80°С до уплотнения среды и два дня подряд по 60 минут при 80°С. ^ В 1000 мл воды вносят 400 г говяжьей печени, стерилизуют 120 минут текучим паром и фильтруют через марлю. Устанавливают рН 7,0. Фильтрат разливают по емкостям и стерилизуют при 100°С по 20 минут в течение 3 дней. ^ Используют для культивирования М. paratuberculosis. Смешивают 4 части печеночного (рН 7,3) и 8 частей телячьего бульона (рН 7,3), добавляют 3% агар-агара. После растворения агара смесь фильтруют, вносят 5% глицерина и 1 часть глицериновой вытяжки из М. phlei, стерилизуют при 115°С 20 минут. Среду охлаждают до 55°С. Добавляют 1 часть сыворотки крови крупного рогатого скота, прогретой при 56-58°С, разливают по пробиркам и окрашивают. ^ Бактериальную массу М. phlei, выращенную на глицериновом бульоне, фильтруют через бумажный фильтр. 5 г биомассы растирают с 30 мл 20%-ного раствора глицерина в дистиллированной воде, встряхивают, прогревают при 110-120°С 1,5 ч. Центрифугированием отделяют жидкую часть, которую и используют для изготовления среды. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
отлично
1
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям