Учебно-методическое пособие Минск бгму 2010 удк

света вследствие своего одинакового со стеклом коэффициента преломления (рис. 3). В этом случае падающий на препарат пучок света не рассеивается и, не меняя направления, попадает в иммерсионный объектив; разрешающая способность микроскопа увеличивается.

Иногда вторую каплю иммерсионной жидкости помещают на верхнюю линзу конденсора. В редких случаях используют водную иммерсию, в этом случае устанавливают объектив «ВИ».



Рис. 3. Схема хода лучей в сухой и иммерсионной системах

Увеличение микроскопа равно произведению увеличения объектива на увеличение окуляра. Сухие объективы могут иметь увеличение 8, 10, 20, 40, иммерсионные – 90, 100. Окуляры могут иметь увеличение 7, 10, 12, 15. Обычный световой микроскоп даёт увеличение в 100–400 раз, иммерсионный – в 1000 раз.

Качество микроскопа зависит не от степени увеличения, а от его разрешающей способности – минимального расстояния между двумя точками, которое ещё можно различить. Невооружённый человеческий глаз имеет разрешающую способность около 100 мкм. Разрешающая способность светового микроскопа ограничена длиной световых волн. В световых микроскопах с иммерсионной системой при использовании видимой части дневного света можно рассмотреть объекты около 0,2 мкм. Размеры микроорганизмов, имеющих клеточное строение, составляют 0,2–20 мкм (чаще 0,5–10 мкм) и они легко обнаруживаются в иммерсионном микроскопе.

Структуру препарата можно различить лишь тогда, когда разные его частицы по-разному поглощают или отражают свет либо отличаются одна от другой (или от окружающей среды) показателем преломления. Эти свойства обусловливают контрастность изображения – различие яркостей изображения и фона. Если это различие составляет менее 3–4 %, то его невозможно уловить.


Другие методы световой микроскопии выбираются в зависимости от характера и свойств изучаемых объектов.

^ Темнопольная микроскопия (ТПМ) – микроскопия с боковым освещением (ультрамикроскопия), позволяет обнаружить частицы размером в несколько миллимикронов, которые не видны в светлопольном микроскопе.

Принцип ТПМ. Микроскопия в тёмном поле зрения основана на явлении дифракции света при сильном боковом освещении взвешенных в жидкости мельчайших частиц (эффект Тиндаля).

Эффект тёмного поля создаётся с помощью специального темнопольного конденсора, имеющего боковую зеркальную поверхность или обычного конденсора, между линзами которого вкладывают кружок чёрной фотобумаги так, чтобы незначительная периферическая часть линзы оставалась свободной.

При микроскопии препарата в тёмном поле зрения на верхнюю линзу конденсора наносят каплю масла, помещают препарат с предметным стеклом, на которое наносят каплю масла. Наносить масло на обе поверхности необходимо, чтобы при иммерсионной микроскопии проходящие лучи света не преломлялись. Можно использовать и сухую систему (объектив х40) и помещать каплю масла только на верхнюю линзу конденсора. Так как для бокового освещения необходим параллельный пучок света, применяется только плоское зеркало. Вместо масла можно использовать дистиллированную воду.

В темнопольном микроскопе в нативных препаратах изучают живых неокрашенных микроорганизмов, напр., спирохет (рис. 5).

Фазовоконтрастная (ФКМ) микроскопия позволяет исследовать нативные препараты: бесцветные, прозрачные объекты, детали строения которых оптически мало различаются (живые клетки, срезы тканей, микоплазмы).

При ФКМ используют дополнительное фазово-контрастное устройство, состоящее из фазового объектива и фазового конденсора.

^ Фазовый объектив внутри имеет фазовую пластинку с нанесенным кольцом, которое изменяет фазу и уменьшает амплитуду световой волны. Середина кольца составляет 1/2–2/3 от диаметра выходного зрачка объектива, светопропускание кольца – 10–30% в зависимости от типа фазового контраста.

^ Фазовый конденсор имеет кольцевую диафрагму с прозрачным световым кольцом. Размер светового кольца подбирается так, чтобы он соответствовал (или был чуть меньше) размеру фазового кольца объектива.

Изображение кольцевой диафрагмы совпадает с кольцом фазовой пластинки соответствующего объектива.

Принцип ФКМ. Человеческий глаз хорошо определяет изменения интенсивности света, наступающие при прохождении через окрашенные препараты, когда меняется амплитуда колебаний света. Распространение же световых волн в прозрачных однородных объектах не сопровождается потерей интенсивности света. Меняется только скорость прохождения света через объект по сравнению со скоростью его распространения в окружающей среде. Эти изменения называются фазовыми, так как при этом изменяется фаза колебаний прошедшего света. Фазовые колебания света глаз не воспринимает, а наблюдаемые объекты выглядят малоконтрастными, прозрачными.

Рис. 6. Ход лучей в фазово-контрастном микроскопе

Получаемое изображение называется фазово-контрастным.

^ В зависимости от способа получения фазовых колец различают 2 типа фазового контраста:

а) позитивный фазовый контраст, когда фазовое кольцо в объективе технологически получается путем травления, что вносит «опережение» в прямо прошедший свет.

б) негативный (аноптральный) фазовый контраст, когда фазовое кольцо в объективе технологически получается путем нанесения на поверхность стекла тонкой пленки из копоти или меди, поглощающей не менее 10% света. Это вносит «запаздывание» в прямо прошедший свет. При этом изображение объекта с показателем преломления большим, чем у среды, выглядит светлее окружающего темного фона. Аноптральная микроскопия позволяет достичь большей чёткости изображения малоконтрастных живых микроорганизмов.

ФКМ позволяет получить изображения малых прозрачных и бесцветных живых объектов (микроорганизмов, клеток).

Крупные прозрачные объекты рассеивают лучи света на небольшие углы, эти лучи проходят вместе с не отклонёнными через фазовое кольцо. Для крупных объектов фазово-контрастный эффект имеет место только вблизи их контуров, где происходит сильное рассеяние.

^ Люминесцентная микроскопия. Ее принцип основан на использовании явления люминесценции (флюоресценции, холодного свечения) – способности некоторых веществ флюоресцировать, т. е. на доли секунд поглощать падающие на них УФ или коротковолновые (сине-фиолетовые) лучи, а затем снова испускать свет. Испускаемый свет имеет длину волны, превышающую длину волны поглощаемого света на 20–50 нм, т. е. смещен по длине волны в сторону длинноволновой области спектра. Так, например, если поглощается синий свет, то испускается зеленый свет. Зеленый свет преобразуется в желтый, желтый – в красно-оранжевый, а невидимое УФ- излучение – в видимый свет. Такое явление носит название «эффект Стокса».

Первичная (собственная) люминесценция наблюдает­ся без предварительного окрашивания объекта. Вторичная (наведенная) возникает после окраски препаратов специаль­ными люминесцирующими красителями – флюорохромами (акридиновым оранжевым – используют для обнаружения гонококков, аурамином – микобактерий, корифосфином – коринебактерий, ФИТЦ (флюоресцеина изотиоцианатом) – для метки антител).

Основной частью люминесцентного микроскопа является осветитель, имеющий лампу ультрафиолетового цвета, и систему фильтров (рис. 8).



Рис. 8. Схематическое изображение люминесцентного микроскопа

Галогенные лампы непригодны в качестве источника света для люминесцентных исследований, так как металлическая нить накаливания преобразует большую часть потребленной электроэнергии в красный или невидимый инфракрасный свет. При этом лампа имеет непрерывный спектр излучения в широком спектральном диапазоне, непригодный для наблюдения слабосветящихся объектов.

Для работы в свете люминесценции необходим источник света с линейчатым спектром, интенсивным в коротковолновой части. Таким спектром излучения обладают ртутные лампы, работающие по принципу газового разряда. Лампы имеют специфичное светящееся тело. В кварцевую колбу вплавлены два электрода. В зоне горения содержится небольшое количество ртути. За счет разрядов определенной мощности высокого напряжения между электродами возникает электрическая световая дуга, которая поддерживается в «горящем» состоянии.

Ртутная лампа излучает интенсивный свет, содержащий значительную долю УФ-излучения, которое необходимо для наблюдения в свете люминесценции.

В оптическую схему люминесцентного микроскопа вводят два светофильтра. Между зеркалом микроскопа и источником света устанавливают сине-фиолетовый светофильтр. Он пропускает от источника-осветителя только сине-зелёный свет, возбуждающий люминесценцию. Вещества-флюорохромы поглощают падающие на них коротковолновые лучи, переходят в возбуждённое состояние и приобретают иной цвет. Обратный переход в нормальное состояние происходит с испусканием света с большей длиной волны. Сине-зелёный свет мешает видеть возбуждаемое им свечение препарата, поэтому по пути к глазу наблюдателя отсекается жёлтым светофильтром.

Люминесцирующие объекты светятся ярким светом в тёмном поле зрения (рис. 9, 10). Сила их света чаще невелика, поэтому люминесцентную микроскопию проводят в затемнённом помещении.

Преимущества люминесцентной микроскопии:

• 
  цветное светящееся изображение микроорганизмов на чёрном фоне;
  
• 
  обнаружение и установление локализации и концентрации живых и погибших микроорганизмов;
  
• 
  возможность обнаружения микроорганизмов в исследуемом материале в небольших концентрациях вследствие высокой степени контрастности изображения;
  
• 
  при использовании коротких УФ лучей разрешающая способность люминесцентного микроскопа увеличивается до 0,1мкм;
  
• 
  экспресс-идентификация антигенов микроорганизмов в РИФ;
  
• 
  возможность исследования прозрачных и непрозрачных объектов;
  
• 
  возможность исследования жизненных процессов в динамике;
  
• 
  использование люминесцентной микроскопии при цитологических и гистохимических исследованиях, так как флюорохромы могут распределяться в клетке диффузно либо избирательно окрашивать отдельные клеточные структуры или определенные химические соединения биологического объекта.
  

Возможности оптических микроскопов ограничены слишком большой длиной волны видимого света (6000 А). Объекты, размеры которых меньше этой величины, находятся за пределами разрешающей способности светового микроскопа и могут быть обнаружены только при электронной микроскопии.

^ Электронная микроскопия (ЭМ) предполагает использование электронного микроскопа (рис. 11), в котором для освещения объектов вместо светового пучка используются электронные лучи (поток электронов).

Целые клетки из-за своей большой толщины непрозрачны для пучка электронов. Поэтому ЭМ требует специальной подготовки объектов исследования. Материал после фиксации обезвоживают, заливают в эпоксидные смолы, режут стеклянными или алмазными ножами на специальных ультратомах, позволяющих получать ультратонкие срезы толщиной 30–50 нм.

Биологические объекты состоят из веществ, построенных из лёгких элементов (С, N, О, Н, Р, S), поэтому их изображение в электронном микроскопе слабо контрастно и в клетках можно увидеть очень мало структурных деталей. Чтобы сделать изображение более контрастным, клетки обрабатывают электронными красителями – солями тяжёлых металлов (свинца, ртути, хрома, урана, вольфрама). Так как атомы тяжёлых металлов очень сильно рассеивают электроны, то структуры клетки, поглотившие эти металлы, будут выглядеть тёмными и контрастными. В качестве индикаторов для окислительно-восстановительных ферментов в ЭМ используют теллурит калия или соли тетразолия. Эти соединения, проникая в клетки, акцептируют электроны, которые они получают от дегидрогеназ. В результате реакции эти соединения восстанавливаются и выпадают в осадок, имеющий вид электронно-плотных (тёмных на экране микроскопа) зёрнышек, глыбок, слоёв.

^ Таблица 3

Сравнение электронного и светового микроскопов

Параметр	Электронный микроскоп	Световой микроскоп
Источник излучения	электроны	свет
Длина волны	0,005 нм	400-700 нм
Максимальное полезное увеличение	х2500	х1500
Максимальное разрешение	0,2 нм	200 нм
Линзы	электромагниты	стеклянные
Объект	не живой, обезвоженный, маленький или тонкий	живой или неживой
Красители	содержат цветные металлы, которые отражают электроны	цветные

Принцип ЭМ. В качестве источника электронных лучей применяют электронную пушку, основой которой служит вольфрамовая нить, нагретая электрическим током (рис. 12). Электронные лучи обладают малой длиной волны. Прохождение электронных лучей в вакууме через электромагнитные поля, создаваемые электромагнитными линзами, концентрирует и направляет электронный поток. Это обеспечивает резкое повышение разрешающей способности электронного микроскопа до 0,2 нм и увеличение до 10⁹.

В трансмиссионных (просвечивающих) электронных микроскопах электроны проходят через образец, затем собираются и фокусируются электромагнитными линзами. Электроны невидимы для глаза, поэтому они направляются на флюоресцентный экран, который воспроизводит видимое плоскостное изображение, или на фотоплёнку, чтобы получить постоянный снимок (электронную микрофотографию).

Проходя через объект, части которого имеют различную толщину, электроны больше или меньше задерживаются, а объект приобретает контрастность. Создаёт изображение только та часть электронов, которая проходит через объект и попадает на экран микроскопа. Участки клеток, слабо рассеивающие электроны, выглядят на экране светлыми, а участки, сильно рассеивающие электроны, – тёмными (рис. 13).

В сканирующих электронных микроскопах пучок электронов фокусируется в тонком зонде и им сканируют образец, а отраженные от поверхности образца электроны собираются и формируют на экране объемное изображение (рис. 14-17). При сканирующей электронной микроскопии изучают поверхность различных объектов, напыляя на них в вакуумной камере электронно-плотные вещества, и исследуют реплики, повторяющие контуры образца.

Рис. 17. Макрофаги и фагоцитируемые ими

E. coli в сканирующем электронном микроскопе

Преимущества электронной микроскопии:

• 
  высокая разрешающая способность электронного микроскопа позволяет наблюдать объекты, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности светового микроскопа. Поэтому ЭМ применяется для изучения ультраструктур микроорганизмов и макромолекулярных структур;
  
• 
  сочетание ЭМ с другими методами позволяет проводить электронно-радиоавтографические, электронно-гистохимические, электронно-иммунологические исследования. ЭМ нашла широкое применение в морфологии, микробиологии, вирусологии, иммунологии, генетике, биохимии, онкологии.
  

4 этап БСМИ. Заключение.

Оценка БСМИ.

Достоинства:

• 
  простой;
  
• 
  доступный;
  
• 
  быстрый;
  
• 
  экономичный.
  

Недостатки:

• 
  низкая чувствительность световых микроскопов (около 10⁴-10⁵ микроорганизмов в мл), поэтому информативность БСМИ невелика;
  
• 
  низкая специфичность из-за схожести морфологии микроорганизмов разных видов, поэтому результаты его могут использоваться как ориентировочные при индикации высоких таксонов;
  
• 
  обычно, как самостоятельный метод, БСМИ – поздний метод исследования, так как для накопления концентрации микроорганизмов, улавливаемой БСМИ, необходимо время; в то же время БСМИ используется на всех этапах БЛМИ для контроля чистоты выделяемой культуры.
  

^ Таблица 4

Схема микроскопического метода исследования

Цели	Установление этиологии заболевания.
	Определение чистоты выделенной культуры.
Этапы	1 - взятие, хранение и транспортировка материала
	2 - приготовление микропрепаратов	для изучения убитых микроорганизмов: бактериологический мазок мазки из жидкого материала мазки из вязкого материала тонкий мазок крови толстая капля крови препарат-отпечаток препарат-соскоб препарат для ЭМ		окрашивание микропрепаратов	простые методы
					сложные методы
		для изучения живых микроорганизмов: висячая капля придавленная капля
	3 - микроскопия: световая (сухая или иммерсионная система) темнопольная фазово-контрастная люминесцентная электронная
	4 - заключение
Оценка	достоинства		простой доступный быстрый экономичный
	недостатки		низкая чувствительность низкая специфичность обычно поздний метод исследования, используется на всех этапах БЛМИ для контроля чистоты выделяемой культуры

^ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ

НА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ

Облигатные внутриклеточные паразиты (хламидии, риккетсии, вирусы) культивируются исключительно в клеточных системах: на культурах клеток, в куриных эмбрионах, в организмах чувствительных лабораторных животных. Культивирование же бактерий (накопление микробной биомассы) осуществляется на питательных средах.

Питательная среда  субстрат для выращивания бактерий в лабораторных или производственных условиях.

^ Требования к питательным средам. В питательных средах создают необходимые условия для роста и размножения бактерий. Питательные среды должны:

• 
  содержать все элементы, из которых строится бактериальная клетка, в такой форме, в которой микроорганизмы способны их усваивать; среды должны содержать источники C и N, минеральные соли, в ряде случаев ростовые факторы (аминокислоты, пурины, пиримидины, витамины);
  
• 
  быть влажными, чтобы процесс диффузии питательных веществ в клетку проходил без затруднений;
  
• 
  быть прозрачными (жидкие среды), чтобы можно было визуально наблюдать за ростом микроорганизмов;
  
• 
  быть стерильными, чтобы знать какому микробу принадлежат те или иные свойства;
  
• 
  быть изоосмотичными (за счет 0,85% NaCl);
  
• 
  иметь определённое значение pH и обладать буферными свойствами.
  

Большинство патогенных бактерий, адаптированных к относительно стабильному микроокружению организма человека, растут преимущественно при близких к нейтральному значению рН 6,57,6. Холерный вибрион способен расти на средах с щелочным рН 8,09,0 (щелочная пептонная вода, щелочной агар), а грибы микромицеты растут на средах с кислым рН 4,06,0 (среда Сабуро). Сапрофиты адаптированы к росту в более широком диапазоне рН 2,09,0. Величина рН среды влияет на метаболизм бактерий, воздействуя на растворимость питательных веществ. В процессе роста микроорганизмов величина рН среды может резко меняться, что требует поддержания определённого рН особенно для тех микроорганизмов, которые продуцируют кислоты, но не обладают к ним толерантностью (лактобациллы, энтеробактерии). Для этого в состав среды вводят либо несбраживаемые веще­ства (неорганические фосфаты, карбонат кальция или бикарбонат натрия), либо буферы (фосфатный, трис-солянокислый, цитратный и ацетатный).

^ Классификации питательных сред (табл. 5).

Таблица 5

Классификации питательных сред

^ Классификационный признак	Виды сред
Происхождение	естественные искусственные (простые и сложные) синтетические
Состав	минимальные полные
Консистенция	жидкие полужидкие плотные свёрнутые сыпучие
Назначение	общего назначения элективные дифференциально-диагностические индикаторные хромогенные
^ Цель использования	транспортные обогащения для получения изолированных колоний для накопления чистой культуры для идентификации чистой культуры консервирующие

^ I. По происхождению:

1. Естественные. Их готовят из естественных продуктов животного и растительного происхождения (мяса, молока, яиц, отрубей, картофеля, моркови, пивного сусла, сенного отвара, сливового или морковного сока, кокосового молока, сыворотки крови). Эти среды не имеют постоянного состава, а потому не стандартны. В настоящее время их используют в качестве добавок к искусственным средам.

2. Искусственные. Они содержат в качестве источников аминного азота высокомолекулярные органические компоненты (пептон, триптон, мясной экстракт, казеин), которые получают из продуктов животного и растительного происхождения, очищают и дегидратируют. Эти среды готовят из ингредиентов по определенной рецептуре, соответствующей ростовым потребностям культивируемых микроорганизмов. Состав их относительно постоянен, они стандартны, доступны и широко используются в диагностических лабораториях. Эта группа сред делится на:

а) простые среды, которые имеют достаточно простую рецептуру; в их состав входят источники аминного азота (пептон/триптон/мясной экстракт), а также соли, поддерживающие изотонические свойства и рН среды; предназначены для культивирования нетребовательных микроорганизмов. Примеры: мясная вода (МВ), пептонная вода, мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА).

б) сложные среды, которые получают путём добавления к простым питательным средам стимулирующих добавок  дрожжевого экстракта, сахаров, микроэлементов, витаминов, крови, сыворотки, гемина, пивного сусла и т. д., которые усиливают ростовые свойства и позволяют культивировать определенные виды микроорганизмов, в том числе привередливые.

3. Синтетические. Они состоят из низкомолекулярных неорганических и орга­нических соединений, в качестве источника аминного азота в эти среды входят аминокислоты. Синтетические среды имеют известный количественный и качественный состав ингредиентов: аминокислот, химически чистых аммонийных и азотнокислых солей, витаминов, микроэлементов и других факторов роста. Используют для культивирования микроорганизмов с целью получения вакцин и антибиотиков, изучения ростовых потребностей, а также для пассирования культур клеток.

^ II. По составу:

1. Минимальные  соответствуют минимальным потребностям микроорганизмов в питательных веществах. Мини­мальные среды используют в ге­нетических исследованиях.

2. Полные  содержат все необходимое для роста бактерий.

III. По консистенции:

1. 
   Жидкие (мясо-пептонный, сахарный, кровяной, желчный бульоны, пептонная вода, молоко).
   
2. 
   Полужидкие - содержат 0,5% агара (полужидкий агар).
   
3. 
   Плотные – содержат уплотнители, придающие среде желеобразную консистенцию. В качестве уплотнителей могут использоваться:
   

• 
  агар (по-малайски желе) – очищенный полисахарид из морских водорослей, который добавляют к жидким средам в концентрации 1–3% (обычно 15–20г/л). Плавится при 100⁰С, застывает  ниже +45⁰С; разлагают его немногие бактерии;
  
• 
  желатин - он разжижается многими микроорганизмами и имеет низкую температуру плавления (2630⁰С), поэтому редко используется в качестве уплотнителя;
  
• 
  силикагель - используется в случаях, когда требуются плотные среды, не содержащие органических компонентов (для хемолитотрофов).
  

4. 
   Свёрнутые  плотные среды, содержащие сыворотку крови или яичный белок, которые в процессе температурной коагуляции приобретают плотность.
   
5. 
   Сыпучие  пшено, отруби и др., используют для длительного хранения микроорганизмов на поверхности среды.
   

^ IV. По назначению:

1. 
   Общего назначения, основные (МПБ, МПА). На них растут многие нетребовательные микроорганизмы (псевдомонады, энтеробактерии, стафилококки).
   
2. 
   Элективные (селективные, избирательные) содержат вещества, подавляющие рост сопутствующей микрофлоры и усиливающие рост определенных видов или родов микроорганизмов. В качестве селективных добавок используют антибиотики, антисептики (фурагин), анилиновые красители (феноловый красный, метиленовый синий, эозин, малахитовый зеленый), соли (теллурит калия, 4-9% NaCl, селенит натрия), желчь. Примеры элективных сред: для стафилококков  желточно-солевой агар, для синегнойной палочки – фурагиновый агар.
   
3. 
   Дифференциально-диагностические позволяют отдифференцировать по внешнему виду колоний и биохимической активности одну группу микроорганизмов от другой при посеве биологического материала со смешанной микрофлорой. Содержат углеводы, индикаторы рН, селективные добавки. Примеры дифференциально-диагностических сред: для энтеробактерий  Эндо, Левина, Плоскирева, для клебсиелл  лактозо-бромтимоловый агар с пенициллином, для Clostridium difficile  фруктозо-циклосерин-цефокситиновый агар.
   
4. 
   Индикаторные. В состав таких сред кроме индикатора рН (табл. 6) входят углеводы, либо аминокислоты, при разложении которых изменяется рН и как следствие этого  цвет среды.
   

^ Таблица 6

Наиболее часто используемые индикаторы рН в питательных средах

^ Название индикатора	Окраска индикатора в зависимости от значения рН
	щелочное	нейтральное	кислое
Андреде	бесцветный	бесцветный	красный
^ Бромтимоловый синий	бирюзовый	зеленый	желтый
^ ВР (водный голубой+розоловая кислота)	малиновый	бесцветный	синий
^ Феноловый красный	малиновый	красный	желтый

Изначально рН среды устанавливают 7,2±0,2. Эти среды позволяют изучать биохимические свойства чистых культур микроорганизмов и не обладают селективными свойствами. Примеры индикаторных сред: среды Гисса, Клиглера, Олькеницкого.

5. 
   Хромогенные. Новый тип диагностических сред, получающий в последнее время широкое распространение в ускоренной диагностике инфекционных заболеваний. На хромогенных средах по цвету колоний можно проводить предварительную идентификацию микроорганизмов (рис. 18).
   

^ V. По цели использования в схеме бактериологической диагностики инфекционных заболеваний:

1. 
   Транспортные. Их используют на этапах доставки биологического материала в бактериологическую лабораторию; состав этих сред такой, что бактерии сохраняют жизнеспособность, но не размножаются в них, поэтому количественный и качественный состав микрофлоры не изменяется.
   
2. 
   Среды обогащения – жидкие среды, которые подавляют сопутствующие возбудителю микроорганизмов (щелочная пептонная вода для холерного вибриона, среды с желчью для энтеробактерий) и стимулируют рост возбудителя.
   
3. 
   Среды для получения изолированных колоний.
   
4. 
   Среды для накопления чистой культуры.
   
5. 
   Среды для идентификации микроорганизмов.
   
6. 
   Консервирующие  для длительного хранения микроорганизмов в условиях морозильной камеры. Эти среды содержат криопротекторы (10% глицерин), защищающие мембраны в процессе замораживания; необходимы для создания коллекций микроорганизмов.
   

^ Приготовление питательных сред.

Большинство сред, используемых в бактериологии, представляют собой высушенные концентраты в заводской фасовке, которые взвешивают, растворяют в дистиллированной воде, стерилизуют и разливают в лабораторную посуду. Этапы приготовления таких сред следующие:

1. 
   Взвешивают навеску сухой концентрированной среды в соответствии с инструкцией по применению.
   
2. 
   Растворяют навеску в соответствующем объеме дистиллированной воды.
   
3. 
   Доводят до кипения при постоянном перемешивании и кипятят 1 мин до полного растворения компонентов. Доводят рН среды до требуемой величины  обычно, 7,2±0,2.
   
4. 
   Разливают среду в подготовленную посуду, закрывают ватно-марлевыми пробками, стерилизуют в автоклаве при +121⁰С в течение 15 мин. Среды с углеводами стерилизуют при +115⁰С в течение 15 мин.
   
5. 
   После охлаждения среды до 4550⁰С добавляют при необходимости селективные и/или стимулирующие добавки: 5% крови, 5% сыворотки, антибиотики, гемин, витамины и др., тщательно перемешивают.
   
6. 
   Разливают среду в стерильные чашки Петри по 20 мл на чашку (чтобы глубина агарового слоя составляла не менее 4 мм), равномерно распределяют, оставляют до застывания. Используют стерильные одноразовые пластиковые чашки Петри или стеклянные, многоразового использования, предварительно простерилизованные.
   
7. 
   После застывания среды её подсушивают от конденсата в термостате в течение 30 мин. Для этого на полку термостата кладут лист фильтровальной бумаги и помещают чашку так, чтобы крышка служила опорой для края её дна, перевёрнутого средой вниз.
   
8. 
   При необходимости чашки Петри с готовой средой можно хранить в запаянном полиэтиленовом пакете при +2+8⁰С в течение 710 суток; перед посевом среды подсушивают в термостате до исчезновения конденсата на внутренней поверхности крышки.
   

^ Рост бактерий в жидких питательных средах.

При росте бактерий в жидких питательных средах могут наблюдаться:

1) равномерное помутнение среды типично для большинства факультативно-анаэробных бактерий; при этом степень помутнения может быть слабой, умеренной или сильной;

2) придонное или пристеночное помутнение среды специфично для стрептококков и облигатно анаэробных бактерий; осадок может быть плотным, рыхлым, слизистым или хлопьевидным;

3. 
   плёнка на поверхности среды характерна для аэробов, плёнка может быть тонкой, плотной, рыхлой, гладкой, складчатой. Рост в виде пленки характерен, напр., для Yersinia pestis (от пленки вниз спускаются нити- «сталактиты») и Vibrio cholera (нежная пленка).
   

Рост бактерий на плотных питательных средах.

На плотной питательной среде из одной микробной клетки вырастает скопление микроорганизмов  колония. Морфотипы колоний, вырастающих на средах, зависят от видовой принадлежности микроорганизма и позволяют идентифицировать и дифференцировать микроорганизмы.

На плотных питательных средах колонии микроорганизмов могут отличаться размерами, формой, краем, поверхностью, прозрачностью, структурой и консистенцией, профилем, цветом и запахом (табл. 7, рис. 19).

Таблица 7

Признаки колоний микроорганизмов

^ Признаки колоний
размер (диаметр, мм)	форма	край	поверхность
точечные - до 1мм мелкие - 1-2мм средние - 2-4мм крупные - >4мм	правильная (круглая) неправильная (волокнистая, ризоидная, веретеновидная)	ровный волнистый зубчатый лопастной складчатый	матовая блестящая складчатая морщинистая
прозрачность	консистенция (определяют, прикасаясь к колонии бакпетлёй)	профиль	цвет
непрозрачные (стафилококки, бациллы) полупрозрачные (энтеробактерии, бактероиды) прозрачные как «капельки росы» (гонококки, вибрионы)	вязкая, тянущаяся сухая, плотная	плоский высокий выпуклый подушечкообразный кратерообразный конусовидный пуповидный	бесцветная окрашенная

Способность бактерий образовывать на питательных средах окрашенные колонии определяется одним из двух факторов:

а) цветом пигмента, продуцируемого микроорганизмами. По химическому строению различают каратиноидные, меланиновые и другие пигменты, которые могут быть красного, оранжевого, жёлтого, коричневого, чёрного, синего или зелёного цвета. Пигментообразование детерминируется генетически. Пигменты обычно находятся в ЦПМ и защищают микробные клетки от эффектов фотоокисления, поэтому пигментообразование больше характерно для воздушной микрофлоры и служит фактором защиты от УФ. Чаще пигменты нерастворимы в питательных средах и окрашивают только колонии. Некоторые пигменты растворимы в воде (например, пиоцианин у псевдомонад) и потому диффундируют в среду, окрашивая её.

Примеры микроорганизмов, продуцирующих пигменты:

^ Staphylococcus aureus  оранжево-желтый каротиноидный пигмент;

Pseudomonas aeruginosa – сине-зеленый пигмент пиоцианин (при нейтральной реакции - синий, при щелочной – зелёный);

Prevotella melaninogenica, Peptostreptococcus niger – коричнево-черный пигмент.

б) составом среды, на которой культивируют микроорганизмы. В состав селективных или дифференциально-диагностических сред могут входить:

– индикатор рН, цвет которого меняется при разложении углеводов в составе среды;

– красители, которые могут избирательно накапливаться в колониях ферментирующих углеводы микроорганизмов. Например, ^ Escherichia coli разлагают лактозу и образуют на среде Эндо колонии малиново-красного цвета, а на среде Левина – фиолетового, колонии Salmonella spp. и Shigella spp., не разлагающих лактозу, на этих средах бесцветны или слабо-розовые.

– соли двухвалентных металлов, которые окрашивают колонии сероводородпродуцирующих микроорганизмов в серый или черный цвет (черные или серые колонии образуют сальмонеллы на висмут-сульфитном агаре, коринебактерий дифтерии на телуритовом агаре).

а б в



г д е

Рис. 19. Колонии микроорганизмов: а – микобактерий, б – бацилл сибирской язвы, в – нокардий, г – бактероидов, д – клостридий, е – бордетелл коклюша

Несмотря на множество признаков, которыми различаются колонии, большинство микроорганизмов образуют на средах один из четырех морфотипов колоний:

– гладкие, или S-колонии (от англ. smooth - гладкий) имеют ровные края, гладкую поверхность; они выпуклые, блестящие. S-формы микроорганизмов более вирулентны (исключая Y. pestis, B. anthracis). Такой вид колоний обусловлен присутствием в составе наружных оболочек микроорганизмов гидрофильных полисахаридов.

– шероховатые, или R-колонии (от англ. rough - шероховатый) имеют неровный край, исчерченную поверхность, они плоские, не блестят. R-формы микроорганизмов часто авирулентны. Такой вид колоний связан с гидрофобностью наружных оболочек бактерий из-за отсутствия в них гидрофильных полисахаридов.

– слизистые, или мукоидные, или М-колонии (от англ. mucus – слизистый) – у клебсиелл, имеющих выраженную полисахаридную макрокапсулу;

– карликовые, или D-колонии – у микоплазм и L-форм; видны только под малым увеличением микроскопа.

Под действием ряда факторов может происходить переход бактерий из S- в R-формы, называемый диссоциацией. Явление диссоциации у патогенных микробов наблюдается:

а) под действием химиопрепаратов;

б) под действием факторов иммунитета;

в) при попадании микроба во внешнюю среду.

При обилии в засеваемом материале микробов они растут в виде плёнки, покрывающей всю поверхность плотной питательной среды. Такой характер микробного роста получил название газонного. Посев газоном производят, когда нужно получить большие количества чистой микробной культуры (например, при определении чувствительности её к антибиотикам).


^ Стадии (фазы) роста бактериальной культуры на питательной среде (рис. 20).

Каждая фаза роста культуры в питательной среде характеризуется определённым размером клеток, скоростью размножения и потребления субстрата, синтезом метаболитов.

^ A – фаза задержки роста (начальная стационарная), или лаг-фаза (от англ. lag – отставание), в среднем длится 1–2 ч. Начало лаг-фазы связано с адаптацией клеток к среде обитания. Важную роль играет «предыстория» выращивания посевной культуры. Если использован инокулят из культуры с резко отличающимися условиями выращивания, то клеткам требуется время на синтез новых рибосом, РНК и адаптивных ферментов. В этом периоде увеличивается размер клеток, в 8–12 раз повышается содержание РНК. Деления клеток при этом почти не происходит. Полноценная среда, физиологически активная посевная культура, которая подготовлена к синхронному делению, способствуют короткой лаг-фазе (или её отсутствию) и переходу ко II фазе. Синхронизации можно достичь с помощью понижен­ной температуры, ограничения питательных веществ, фильтрации, обеспечивающей пропускание клеток определенного размера. Синхронизация длится 2–4 генерации, а далее наступает асинхронный рост.

^ B – короткий период положительного ускорения между фазами A и B, когда начинается деление бактерии.

C – фаза логарифмического (экспоненциального) роста начинается, когда скорость роста клеток всей популяции достигает постоянной величины, средняя продолжительность её 5–6 ч. Скорость деления клеток максимальная, но клетки имеют наименьший размер. Популяция бактериальной культуры состоит из делящихся клеток и достаточно стандартна по своим свойствам (содержание белка, НК, наиболее выраженные видовые признаки), поэтому эта фаза удобна для определения многих параметров популяции (плотность бактерий, скорости роста и потребления субстрата, содержание биополимеров клетки). В этот период отмечено снижение резистентности к агрессивным веществам.

Несмотря на постоянную скорость роста популяции бактерий в логарифмической фазе, отдельные клетки все же находятся в разных стадиях деления. Иногда важно синхронизировать рост всех клеток популяции, то есть получить синхронную культуру. Простыми методами синхронизации являются изменение температурных условий или культивирование в условиях недостатка питательных веществ. Вначале культуру помещают в неоптимальные условия, затем сменяют их оптимальными. При этом у всех клеток популяции синхронизируется цикл деления, но синхронное деление клеток происходит обычно не более 3-4 циклов.

^ D – фаза замедления скорости роста (отрицательного ускорения) длится около 2 ч. Количество питательных веществ существенно уменьшается (отмечается воздействие на бактерии лимитирующих факторов), в культуральной жидкости накапливаются метаболиты, в том числе токсичные для бактерий (отмечается ингибирующее воздействие) и скорость деления клеток снижается.

^ E – стационарная фаза, или фаза максимальной концентрации (М-концентрация). Клетки перестают делиться. Однако, количество живых клеток постоянно, так как количество жизнеспособных бактерий соизмеримо с количеством отмирающих. В этот период клетки переходят на эндогенные субстраты (окисляют запасные вещества, белки, углеводы, липиды). Длительность стационарной фазы различается у разных микроорганизмов. Напр., у Escherichia coli она наступает через 18–24 ч, у Azotobacter – через 72 ч с момента внесения инокулята в питательную среду.

F – фаза отмирания, характеризуется массовой гибелью бактерий. В бактериальной популяции отмечается образование инволюционных форм, аутолиз под действием собственных ферментов. У бактерий меняются морфологические и биохимические свойства. Гибель может наступить через несколько дней, недель, месяцев.

В эту фазу различают периоды ускоренной гибели (количество живых клеток начинает снижаться с увеличивающейся скоростью), логарифмической гибели (количество живых клеток убывает с максимальной скоростью), уменьшения скорости гибели (количество живых клеток убывает с уменьшающейся скоростью) и стационарную фазу минимума (количество живых клеток минимально).


^ Управляемое культивирование микроорганизмов.

Промышленное использование микроорганизмов требует получения значительного количества микробного продукта (биомассы микроорганизмов, продуцируемых ими антибиотиков, токсинов и др.). Для этого используют методы управляемого культивирования микроорганизмов. Управляемое культивирование проводят в специальном оборудовании  биореакторах, которые позволяют создавать благоприятные и равномерные условия для роста и размножения микроорганизмов, что повышает накопление их биомассы и метаболитов, сокращает время культивирования. Управляемое культивирование может быть периодическим или непрерывным, аэробным или анаэробным, поверхностным или глубинным (во всей толще жидкой питательной среды), защищенным (асептическим) или незащищенным.

Периодическое культивирование микроорганизмов – выращивание микроорганизмов в стационарных условиях (в питательной среде без непрерывного поступления нутриентов извне). В таких условиях по мере роста микроорганизмов происходит снижение количества белковых и углеводных субстратов, снижение окислительно-восстановительного потенциала и рН, что приводит к гибели культуры. Для периодического культивирования используют специальное оборудование  ферментеры, в которых осуществляют постоянное перемешивание и аэрацию (барботаж) среды. Периодически ферментер опорожняют, производят выделение и очистку продукта, после чего начинают новый цикл. Существует несколько вариантов периодического культивирования:

• 
  продлённое периодическое культивирование, или культивирование с дробным дозированием субстрата  подпитывают культуру периодически добавляя питательные вещества;
  
• 
  многоциклическое культивирование  часть культуры предыдущего цикла переносят в новую среду;
  
• 
  отъемно-доливное культивирование  в середине экспоненциальной фазы роста отбирают половину культуральной жидкости, а вместо неё вносят свежую питательную среду.
  

Непрерывное культивирование микроорганизмов  выращивание микроорганизмов в динамических условиях (в постоянно обно­вляемой питательной среде). Проводят в специальных биореакторах  хемостатах или турбистатах, которые снабжены устройствами для поддержания температуры и рН на постоянном уровне, а также для автоматической подачи свежей питательной среды и удаления культуральной жидкости с продуктами метаболизма. Микробная популяция тем самым поддерживается необходимое время в ло­гарифмической фазе роста. Управление скоростью поступления питательных веществ в проточных биореакторах осуществляется двумя способами турбидостатным и хемостатным.

В турбидистате управление культивированием проводят путем измерения мутности выходящего потока с использованием фотоэлектрического элемента. Скорость разбавления свежей средой устанавливают в зависимости от требуемой плотнос­ти выходящей из турбидистата культуры.

В хемостатах управление культивированием проводят путем лимитирования концентрации одного из ростовых факторов в поступающей в хемостат среде (например, концентрацию глюкозы, фосфора, серы), тем самым изменяют плотность микробных клеток в единице объёма среды.

^ МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР АЭРОБНЫХ И ФАКУЛЬТАТИВНО-АНАЭРОБНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

I. Методы механического разобщения бактерий.

1. Посев материала на чашки Петри бактериальной петлёй, шпателем, пипеткой, последовательно на несколько сред, не прокаливая инструмент (по Дригальскому). При таком посеве материал, находящийся на петле, расходуется постепенно, и по линиям сетки, нанесённым в конце посева, вырастают изолированные колонии бактерий.

2. Посев пластинчатыми разводками (метод рассева в глубине среды по Коху) применяют, если в исследуемом материале содержится много бактерий. Готовят десятикратные разведения материала в пробирках, затем выливают содержимое пробирок в стерильные чашки Петри, заливают 20 мл расплавленного и остуженного до 45⁰С МПА, перемешивают, дают агару застыть и инкубируют чашки в термостате.

3. Разобщение на основе подвижности бактерий. Материал засевают в каплю конденсационной жидкости скошенного МПА. При этом подвижные бактрии как бы «мигрируют» вверх по агаровому скосу и вырастают в виде колоний, расположенных в верхней части скошенного агара. При 2–3-кратном пассировании этих колоний в конденсационную жидкость скошенного агара удается получить чистую культуру подвижной бактерии (например, протея).

4. Разобщение на основе размеров микроорганизмов используют для получения чистых культур вирусов и микоплазм. Для этого смесь микроорганизмов фильтруют через микро- и миллипористые фильтры. Чистые культуры микроорганизмов получают в фильтрах.

^ II. Метод заражения чувствительных лабораторных животных (биологический) основан на избирательной чувствительности животных к микроорганизмам различных видов. Это выражается в быстрой скорости размножения определенного вида микроорганизмов при попадании в кровь и внутренние органы животного, откуда их затем выделяют. При этом другие виды микробов погибают под действием защитных факторов организма животного. Так выделяют, например, чистую культуру пневмококков из организма белой мыши, чистую культуру палочки туляремии из организма морской свинки.

^ III. Методы, основанные на избирательной чувствительности микроорганизмов к воздействию внешних факторов (предварительно или во время культивирования):

а) физических факторов:

- высокой температуры: спорообразующие бактерии родов Clostridium и Bacillus выживают при нагревании смеси микробов, а неспорообразующие - гибнут;

- низкой температуры: при пониженных температурах культивируют Y. enterocolitica, Y. pestis, L. monocytogenes;

б) химических факторов:

- кислот: при обработке кислотой смесей кислотоустойчивых и некислотоустойчивых бактерий, последние гибнут, а кислотоустойчивые (возбудители туберкулёза) остаются в чистой культуре; использование среды Сабуро (рН 5-6) для выделения грибов;

- щелочей: использование щелочной пептонной воды для выделения V. cholerae; использование метода гомогенизации мокроты с 10% NaOH при выделении M. tuberculosis;

- солей: на элективных средах растут определённые виды бактерий (например, стафилококк растёт на ЖСА, содержащем 10–15% NaCl);

- антибиотиков: основан на избирательной чувствительности определённых видов бактерий к отдельным антибиотикам. При посеве смеси бактерий на среду с добавлением антибиотика, вырастают нечувствительные к нему бактерии: выделение микоплазм на средах с пенициллином, выделение анаэробов на средах с аминогликозидами.

- красителей: красители добавляют к питательным средам для подавления роста сопутствующей флоры: при выделении энтеробактерий в среду Левина добавляют метиленовый синий и эозин для подавления грамположительных бактерий, при выделении микобактерий в среду Левенштейна-Йенсена добавляют малахитовый зелёный.

- специфических ингибиторов: среда с теллуритом калия используется для выделения C. diphtheriae, среда с селенитом натрия используется для выделения Salmonella, среды с желчью используются для выделения энтеробактерий и бактероидов.