Учебно-методическое пособие Минск бгму 2010 удк
|
|
Скачать 1.83 Mb.
|
|
Характеристика стадий ПЦР
Примечание. температура отжига зависит от нуклеотидного состава праймера и рассчитывается математически. 4  Рис. 34. Источник тока и камера для электрофореза этап. Визуализация получаемых копий ДНК и регистрация результатов реакции. Образуемый высококонцентрированный раствор ампликонов ДНК прозрачен. Поэтому для выявления ДНК проводят электрофорез в агарозном геле, содержащем флюоресцирующий в УФ-свете ДНК-краситель бромид этидия. ДНК движется в электрическом поле, взаимодействует с этидием бромидом и при просматривании в трансиллюминаторе (источник УФ света) выглядит в виде светящейся оранжевой полоски. Полученные результаты можно документировать, фотографируя электофореграммы с использованием оранжевого светофильтра.  Рис. 35. Камера для электрофореза с агарозным гелем Проведение электрофореза (рис. 34, 35). Агарозный гель (0,5–4%) с лунками для образцов опускают в аппарат для проведения электрофореза, так чтобы лунки находились в области катода. В камеру для электрофореза заливают трис-ацетат-ЭДТА буфер так, чтобы толщина слоя жидкости над гелем составляла 12 мм. Образец смешивают с загрузочным красителем в соотношении 1:6 и вносят 6 – 20 мкл в лунку в геле. Обычно одновременно исследуют много образцов. Загрузочный краситель (зеленый, синий) имеет скорость движения, схожую с ДНК, поэтому по его перемещению судят о местонахождении ДНК в геле. В зависимости от плотности тока время проведения электрофореза составляет от 30 мин до 24 ч. После проведения электрофореза гель вынимают из камеры и переносят на столик трансиллюминатора, где бромистый этидий, связавшийся с ДНК, флюоресцирует в УФ-свете (230 нм), давая оранжевое свечение. 5 этап. Анализ и интерпретация результатов реакции (рис. 36). Для оценки результатов учитывают опытные лунки, а также лунки с положительным и отрицательным контролем (рис. 37, табл. 14).  Рис. 36. Автоматизированная система визуализация гелей – трансиллюминатор, видеокамера, компьютер  1 2 3 4 5 Рис. 37. Электрофореграмма продуктов ПЦР при диагностике возбудителя бактериальной инфекции: 1- маркер молекулярного веса; 2 - положительный контроль; 3 – результат положительный; 4 - результат отрицательный; 5 – отрицательный контроль Рис. 24. Электрофореграмма продуктов ПЦР при диагностике возбудителя бактериальной инфекции: 1-3 – результат положительный; 4, 5 – результат отрицательный; 6 – отрицательный контроль; 7 – положительный контроль. ^ Анализ результатов ПЦР
При интерпретации результатов ПЦР следует помнить, что могут быть получены как ложноположительные, так и ложноотрицательные результаты. Ложноположительные результаты могут наблюдаться в результате контаминации при нарушении правил проведения ПЦР. Ложноотрицательные результаты могут наблюдаться в результате снижения чувствительности ПЦР при ингибировании реакции компонентами биологических образцов. ^
^ Анализ амплифицированных фрагментов позволяет: 1) идентифицировать микроорганизмы; 2) выявлять подтипы микроорганизмов одного вида; 3) выявлять мутации в ДНК. Внутривидовое типирование особенно важно при проведении эпидемиологических исследований. По сравнению с традиционными фенотипическими методами, генотипирование на основе ПЦР отличается универсальностью, более глубоким уровнем дифференциации, возможностью использования количественных методов для оценки идентичности штаммов. 1. Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ, англ. - RFLP). Используя ПЦР, амплифицируют определенный генетический локус. Далее продукт амплификации расщепляют рестрикционными эндонуклеазами. При этом образуются фрагменты различного размера, которые при проведении электрофореза образуют профили, различные у разных видов (вариантов) микроорганизмов. 2. Полиморфизм длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ, англ. – AFLP). В отличие от предыдущего метода рестрикцию проводят до ПЦР. ДНК тест-микроорганизма с использованием рестриктазы нарезают на фрагменты, затем проводят ПЦР. В результате образуются фрагменты различного размера, которые при проведении электрофореза образуют профили, различные у разных видов (вариантов) микроорганизмов. 3. Полиморфизм конформации однонитевой ДНК (ПЦР-SSCP). Используют для выявления точечных мутаций в ДНК. Проводят ассиметричную ПЦР, что сопровождается накоплением однонитевых молекул ДНК, которые разделяют при помощи электрофореза в денатурирующем геле, позволяющем разделять фрагменты, отличающиеся друг от друга одним нуклеотидом. ^
Этапы секвенирования.
а) приготовление реакционной смеси, которая содержит: - изучаемую ДНК, - праймер, - ДНК-полимеразу и буфер для неё, - дезоксинуклеотидтрифосфаты (дАТФ, дТТФ, дГТФ, дЦТФ), - меченые флюоресцентной меткой дидезоксинуклеотиды, которые обрывают синтез цепочки ДНК, так как лишены 3'-OH группы, необходимой для образования мостика между двумя нуклеотидами; б) проведение реакции ПЦР-секвенирования; Р  ис. 38. Этапы секвенирования 1. С помощью ПЦР получают множественные копии изучаемого гена, размер которых не должен превышать 1000 п. о. Образуемые в ПЦР ампликоны выявляют электрофорезом. 2. Ампликоны очищают от ПЦР-шлаков (праймеров, нуклеотидов).   3а, б. С помощью флуоресцентно меченых терминаторов синтеза ДНК-цепи, получают множество фрагментов ДНК, синтез которых оборван на аденине, тимине, гуанине, цитозине. Количество получаемых фрагментов ДНК равно сумме А, Т, Г, Ц, присутствующих в секвенируемом фрагменте. 3в. Проводят электрофорез в денатурирующем полиакриламидном геле, в котором разделяются фрагменты ДНК, отличающиеся в один нуклеотид. А Ц Г Т А Ц Г Т 1 1 1 1 2 2 2 2 Образец 1 Образец 2 ^ H37RV GGC ACC AGC CAG CTG AGC CAA TTC ATG GAC CAG AAC AAC CCG CTG TCG GGG TTG ACC CAC AAG CGC CGA 455 GGC ACG AGC CAG CTG AGC CAA TTC ATG GAC CAG AAC AAC CCG CTG TCG GGG TTG ACC GAC AAG CGC CGA 443 GGC ACC AGC GAG CTG AGC CAA TTC ATG GAC CAG AAC AAC CCG CTG TCG GGG TTG ACC GAC AAG CGC CGA Первичная структура секвенированного rpoB гена у контрольного штамма Mycobacterium tuberculosis H37RV и МБТ, выделенных у больных с множественно резистентным туберклезом. у штамма 455 видны мутации в кодоне 508 и 526, у штамма 443 в кодоне 510 и 526 rpoB гена. Эти мутации в rpoB гене являются причиной устойчивости возбудителей туберкулеза к рифампицину. 3г. Результатом секвенирования является линейное символьное описание атомной структуры молекулы ДНК, или первичная структура ДНК.  Сравнение секвенированного фрагмента ДНК с международным банком геномов с помощью программы BLAST позволило идентифицировать фрагмент как rpoB Mycobacterium tuberculosis. 4. Первичную структуру секвенированного фрагмента ДНК идентифицируют с использованием программы BLAST, доступ к которой открыт через сервер http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/. в) электрофорез в денатурирующем полиакриламидном геле для разделения ампликонов, отличающихся размерами в один нуклеотид; г) получение линейного символьного описания атомной структуры молекулы ДНК.
Недостатки секвенирования:
^ Крупномасштабное секвенирование, позволяющее секвенировать большие фрагменты ДНК, например, целую хромосому микроорганизмов. ДНК нарезают на фрагменты при помощи рестриктаз. Эти небольшие фрагменты при помощи вектора переносят в Escherichia coli (клонируют). Микроорганизмы, размножаясь приводят к накоплению клонированной ДНК (клональная амплификация). Далее все разновидности клонированных фрагментов ДНК секвенируют и при помощи компьютера собирают в единую длинную цепочку. Такой подход не требует предварительной информации об изучаемой ДНК, поэтому относится к секвенированию de novo. Секвенирование с использованием гибридизации. В его основу положены гибридизационные биочиповые технологии. При этом неизвестная ДНК обрабатывается флюоресцентным красителем и наносится на чип с большим количеством зондов разной специфичности, находящихся в разных участках чипа. Тот участок чипа, где отмечается сильная флюоресценция, свидетельствует о комплементарности зонда и изучаемой ДНК, что позволяет идентифицировать ДНК, зная характер зонда. ^ Проводится с использованием всех стадий секвенирования по Сенджеру: ПЦР, очистки продуктов амплификации, электрофореза. Реакция осуществляют в специальных чипах, при этом объем реакции измеряется в нанолитриах, что способствует меньшему расходу дорогостоящих реагентов. Чип состоит из трех функциональных частей: 1) камеры для ПЦР; 2) камеры для очистки ампликонов; 3) камеры для капиллярного электрофореза (капилляр имеет длину 30 см и компактно скручен). ^ Эта группа методов используется для определения структуры и функций генов. Модификация генетической информации приводит к утрате или приобретению генов, что сопровождается изменением фенотипа. Заключение о функции гена делают на основании результатов сравнительного изучения фенотипических признаков, присущих исходному и генетически модифицированному микроорганизму. 1. Конъюгация. Используют для картирования генома – определения местоположения генов и расстояния между ними. Способность к конъюгации клеток определяется присутствием плазмиды фертильности – F-плазмиды, которая кодирует конъюгативные пили. F плазмида может интегрировать в бактериальную хромосому, и в таком состоянии носит название Hfr. После образования конъюгационной пары, Hfr фактор инициирует перенос копии бактериальной хромосомы донора в реципиентную клетку, при этом в последнюю очередь переносится в составе бактериальной хромосомы Hfr фактор. Так как перенос всей хромосомы продолжается при 370С около 100 мин, то прерывая конъюгацию в разное время, можно определить какие гены и в какой последовательности попадают в клетку реципиента. Впервые метод использован Жакобом и Вольманом в 1964 году для построения генетической карты Е.coli (рис. 39). 8 мин  thr trp Рис. 39. Первая карта участка хромосомы E.coli, построенная Жакобом и Вольманом в 1964 г. на основании определения времени переноса соответствующего гена из донорской клетки в реципиентную ^ Для постановки классического опыта конъюгации используют взаимно дополняющие друг друга по двум признакам донорский и реципиентный штаммы E. coli (табл. 15). Бульонные культуры донора и реципиента объемом 0,5 мл смешивают, смесь инкубируют 30 мин при 370С. Для выделения рекомбинантных клеток, смесь высевают на минимальную (глюкозосолевую) среду со стрептомицином. В качестве контроля на среду засевают донорский и реципиентный штаммы, которые не способны расти на ней, так как первый штамм чувствителен к стрептомицину, а второй – не синтезирует лейцин. После подсчёта выросших колоний рекомбинантов определяют частоту рекомбинаций, равную отношению количества рекомбинантных клеток к реципиентным. ^
2. Трансдукция – горизонтальный перенос генов от донора к реципиенту умеренными бактериофагами. Для доказательства существования трансдукции может быть приведен опыт по горизонтальному переносу от донора к реципиенту генов β-галактозидазного оперона, контролирующего расщепление лактозы у Е. coli. Для проведения опыта необходимы: реципиент штамм E. coli, лишенный β-галактозидазного оперона (E. coli lac-), на среде Эндо образует бесцветные колонии; трансдуцирующий фаг фаг (λ dgal), в геноме которого часть генов замещена генами β-галактозидазного оперона E. coli. Концентрация фага 106-107 частиц в 1 мл; селективная среда Эндо, на которой лактозоотрицательные колонии бесцветны, а лактозоположительные колонии ярко малиновые, с металлическим оттенком. Постановка опыта трансдукции. Смешивают по 1 мл трехчасовой бульонной культуры реципиента и трансдуцирующего фага. Смесь инкубируют 60 мин при +370С, готовят серию десятикратных разведений. Из пробирки с разведением 10-6 по 0,1 мл культуры высевают на среду Эндо и инкубируют в течение суток. Рекомбинантные клетки растут с образованием малиновых с металлическим оттенком колоний. Частота трансдукций равна отношению количества клеток рекомбинантов к числу реципиентов. 3. Трансформация - горизонтальный перенос генов от донора к реципиенту через внешнюю среду; осуществляемый после гибели бактерий-доноров. Для проведения опыта необходимы следующие материалы: реципиент штамм Bacillus subtilis (strs), чувствительный к стрептомицину; ДНК донора – выделяют из штамма B. subtilis (strr), устойчивого к стрептомицину; селективная среда МПА со стрептомицином. Постановка опыта трансформации. Смешивают по 1мл бульонной культуры B. subtilis и ДНК донора. Инкубируют 30 мин при +370С, и высевают на МПА и МПА со стрептомицином. Рекомбинантные штаммы способны расти на селективной среде со стрептомицином. Частота трансформаций равна отношению количества рекомбинантных клеток к реципиентным. ^ Это совокупность молекулярно-генетических методов, которые позволяют создавать мутации в определенном участке ДНК. Для этого метода необходимо знание первичной структуры исследуемой ДНК, т.е. она должна быть секвенирована. Метод впервые описан в 1978 году Микаэлем Смитом, который в 1993 году получил Нобелевскую премию. Этапы сайт-специфического мутагенеза: а) создание множественных мутантных копий изучаемого гена при помощи ПЦР. Мутантные копии гена получают путем введения мутантных последовательностей в состав праймера, поэтому образуемые в ПЦР копии гена несут известную мутацию (например, чувствительность к ампициллину). б) внесение полученных копий мутантного гена в клетку-реципиент с помощью плазмидного вектора с двойной фенотипической меткой (например, генами устойчивости к тетрациклину и ампициллину). Изучаемый клонированный ген вводят в плазмидный вектор в месте нахождения гена устойчивости к ампициллину. Плазмидный вектор используют в качестве средства доставки клонированного гена в реципиентную клетку. Доставка осуществляется путем электропорации (трансформации под действием мощного электрического разряда) реципиентных клеток. В случае успешно проведенного клонирования реципиентные клетки проявляют чувствительность к ампициллину и приобретают устойчивость к тетрациклину. в) селекция мутантов с помощью метода реплик и использования сред с ампициллином и тетрациклином. ^ Для выделения мутантов используют: а) посев на минимальные среды, лишенные одного из ростовых компонентов. На этих средах растут микроорганизмы, способные синтезировать недостающий компонент. б) посев на селективные среды, содержащие ингибирующие добавки, способствующие избирательному росту устойчивых к ним микроорганизмов. В качестве ингибирующих добавок могут выступать антибиотики, соли, анилиновые красители, желчные кислоты. На этих средах растут микроорганизмы, обладающие факторами устойчивости к ингибирующему агенту. в  А Б Рис. 40. Метод реплик для селекции мутантов: ^ Б – рост мутантных микроорганизмов, устойчивых к ингибирующему агенту, на селективной среде ) посев методом реплик одновременно большого количества изучаемых микроорганизмов (25, 50, 96 культур) при помощи штампа-репликатора. Этапы метода реплик: внесение тест-культур в лунки донышка штампа-репликатора; инокуляция штифтов штампа репликатора тест-культурами (штифты опускают в лунки); посев на среду методом отпечатков; культивирование и учет результатов (рис. 40). На простой ростовой среде вырастают все микроорганизмы, в то время как на селективной среде только мутантные микроорганизмы, устойчивые к ингибирующему агенту. г) использование биосенсоров – молекул-репортеров, которые сообщают о присутствии микроорганизма, его антигенов, метаболитов и т.д. ^ Преимущества молекулярно-генетических методов.
некультивируемые (^ Helicobacter pylori, вирусы папилломы человека, гепатита C, герпеса) или труднокультивируемые (Treponema pallidum); – чрезвычайно чувствительные к условиям взятия клинического материала, транспортировки и культивирования (пневмококки, гемофилы, нейссерии, микоплазмы, облигатные анаэробы); – способные к размножению in vitro только в культуре клеток (вирусы, хламидии, риккетсии); – медленно растущие на искусственных средах (микобактерии, лептоспиры, грибы); – трудно идентифицируемые классическими методами (нокардии, актиномицеты); – находящиеся в полимикробных сообществах (микрофлора кишечника, зубной налет). ^ Генетические методы позволяют обнаружить микроорганизмы в исследуемом материале без выделения их чистых культур, поэтому являются методами экспресс-анализа. Кроме того, большинство используемых методик позволяют получить результат в течение нескольких часов. ^ ысокая производительность. С помощью молекулярно-генетических методов можно параллельно анализировать большое количество образцов. В последнее время появляются станции, в которых автоматизированы процесс выделения ДНК и приготовление реакционной смеси. ^ Для получения результатов не требуется присутствия живого возбудителя, поэтому исследуемый материал может быть дезинфицирован химической или термической обработкой в момент его взятия. Недостатки молекулярно-генетических методов. 1. Отсутствие международных протоколов по молекулярно-генетической диагностике различных нозологических форм заболеваний. ^ В этиологической диагностике заболеваний в настоящее время по-прежнему существуют «золотые стандарты», в основу которых положены культуральный или микроскопический методы исследования. Для постановки этиологического диагноза необходимы положительные результаты культурального и микроскопического методов, результаты молекулярно-генетических методов в настоящее время оцениваются как ориентировочные. Следует помнить, что выявление в клинических образцах ДНК сапрофитных и условно-патогенных микроорганизмов может не означать наличия патологического процесса и поэтому не может быть автоматически интерпретировано как диагноз, особенно на фоне благополучной клинической картины у пациента. По этой же причине следует с осторожностью использовать молекулярно-генетические методы для анализа образцов с полимикробным сообществом (испражнения, материал из верхних дыхательных путей, материал из гениталий). ^ Для проведения молекулярно-генетических исследований необходимо комплексное оснащение лаборатории, включающее термоциклер, устройство для ДНК-электрофореза, трансиллюминатор, шейкеры, центрифуги, холодильники, дозаторы, секвенатор, гибридизационную камеру и другое оборудование. ^
– клетки дезинтегрируют ультразвуком; – белки осаждают; – проводят диализ для освобождения от балласта; – выделяют очищенный белок при помощи жидкостной хроматографии; – проводят электрофорез в полиакриламидном геле; – идентифицируют белок с использованием биомаркеров (меченых поликлональных антител); – изучают белок: определяют молекулярную массу методом масс-спектрометрии, 3D-структуру методом рентгеноструктурной кристаллографии.
– негативного контрастирования с последующей электронной микроскопией (рис. 41); – изучения адгезии к поверхности культур клеток Hep2 и др.; – постановки маннозозависимой реакции гемагглютинации с эритроцитами разных видов животных: при добавлении эритроцитов к суспензии бактерий в присутствии 1% раствора D-маннозы происходит склеивание эритроцитов с образованием «зонтика». ^ определяют с помощью сравнительного компьютерного анализа секвенированного генома микроорганизма и геномов хорошо изученных микроорганизмов. Функции генов подтверждают клонированием этих генов в E. coli или нокаутируют эти гены с использованием сайт-специфического мутагенеза. ^ Наличие капсулы определяют окраской по Бурри-Гинсу (негативное контрастирование), по Книге, в реакции иммунного набухания. Химический состав капсулы и других гликанов определяют путем разделения компонентов с использованием жидкостной хроматографии или капиллярного электрофореза, затем идентифицируют компоненты масс-спектрометрией. Серологические варианты капсульных антигенов или ЛПС выявляют в серологических реакциях (реакции агглютинации, реакции латекс-агглютинации). Патогенные свойства капсулы определяют путем введения капсульного вещества лабораторным животным (биологический метод), что может индуцировать образование абсцессов. 6. Токсигенность свойство бактерий продуцировать и выделять во внешнюю среду экзотоксины (дифтерийный, ботулинистический, токсин Clostridium difficile, холерный, стафилококковый и др.), играющие решающую роль в развитии заболеваний. Если существует несколько серологических вариантов экзотоксина, то определяют его серотип. Определение серотипа токсина имеет важное значение для назначения адекватной серотерапии (лечения сыворотками). Так при ботулизме определение типа токсина позволяет использовать моновалентную сыворотку и сокращает количество чужеродного лошадиного белка, вводимого в организм. Серотипы экзотоксинов выявляют с использованием одного из следующих методов: – ИФА; – реакции преципитации; – реакции обратной пассивной гемагглютинации; – иммунохроматографии с использованием антител, меченных коллоидным золотом; – реакции нейтрализации на животных или в культуре клеток. ^  Рис. 43. Иммуноцитохимическое выявление амидазы В. subtilis с использованием антител, меченных коллоидным золотом и электронной микроскопии Локализацию определенных белков в поверхностных образованиях бактерий определяют иммуноцитохимическим методом. При этом бактерии обрабатывают антителами, меченными коллоидным золотом, а затем исследуют в электронном микроскопе (рис. 43). Золотая метка создает контрастную тень в месте связывания с бактериальными компонентами. Для выявления факторов вирулентности мало изученных возбудителей проводят 2D-электрофорез в геле разрушенных ультразвуком вирулентных и авирулентных форм микроорганизмов, относящихся к одному виду (рис. 44 а, б). Сравнивают электрофореграммы и определяют расхождения между ними. Белки, присутствующие только у вирулентных микроорганизмов, секвенируют. Прогнозируют ген, кодирующий секвенированный белок. Проводят поиск гена в геноме бактерии, клонируют его в Е.coli, выделяют белок с использованием жидкостной хроматографии или капиллярного электрофореза, изучают структуру методами масс-спектрометрии, рентгеноструктурной кристаллографии (рис. 44 в). Аналогичным образом можно изучать не только клеточные лизаты бактерий, но и секретируемые в культуральную жидкость белки и токсины, для чего проводят 2D-электрофорез безмикробной культуральной жидкости. Кроме того, можно не выделять отдельные белки, так как использование масс-спектрометрии позволяет идентифицировать множество пептидов, находящихся в смеси. Для выявления эффектов, оказываемых токсинами на клетки или ткани, проводят эксперименты на культуре клеток и лабораторных животных.    а б в Рис. 44. Сравнительный 2D-электрофорез вирулентных (а) и авирулентных (б) форм одного вида микроорганизмов (стрелками обозначены белки, присутствующие только у вирулентных форм; 3D-структуру этих белков устанавливают рентгеноструктурным анализом (в)) ^ (см. определение биохомических свойств микробов – гемолизинов, лецитиназы, протеаз, липаз, плазмокоагулазы и др.). 9. Для выявления сенсибилизации к микробным аллергенам ставят кожно-аллергические пробы (например, пробу Манту). ^ (пептидов, приводящих к формированию противоинфекционного иммунитета) проводят сравнительный анализ геномов микроорганизмов и определяют спектр генов, которые потенциально могут кодировать протективные антигены. Эти гены клонируют в Е. coli, клонированные белки выделяют и изучают их иммуногенные свойства на лабораторных животных, проводят селекцию наиболее иммуногенных пептидов, которые могут стать компонентом вакцин. Однако следует помнить, что не всегда патогенность возбудителя, выявляемая in vitro, соответствует реакциям, реализуемым возбудителем in vivo. Это связано с различием экспрессии генов в разных условия микроокружения. Молекулярно-генетические методы открыли новые возможности в изучении основных клеточных молекул. Зная геномы и протеомы возбудителей, человек получил возможность проникнуть еще глубже в понимание организации живого. Несмотря на это, пока не были сделаны глобальные открытия, позволяющие контролировать вирулентные свойства микробов, предотвращая развитие заболеваний. ^ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ БАКТЕРИЙ К АНТИБИОТИКАМ Эмпирическое назначение антибиотиков основано на знаниях о природной чувствительности бактерий к антибиотикам, эпидемиологических данных о резистентности микроорганизмов в регионе или стационаре. Несомненным преимуществом эмпирической антимикробной терапии является незамедлительное начало ее проведения. Однако из-за формирования резистентности у микроорганизмов этиотропная антибиотикотерапия может быть неэффективной. Поэтому важно проводить этиотропное назначение антибиотиков, основанное на выделении возбудителя инфекции из клинического материала и определении его чувствительности к антибиотикам (табл. 16). Определение антибиотикорезистентности проводят согласно утвержденным документам – стандартам или приказам, которые регламентируют процедуру определения антибиотикорезистентности микроорганизмов. В РБ существует приказ Министерства здравоохранения по определению антибиотикорезистентности, в Америке и Европе – стандарты Комитета по клиническим лабораторным стандартам (NCCLS). Таблица 16 Классификация методов определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам
^ (МИК) минимальная ингибирующая (подавляющая) концентрация - наименьшая концентрация антибиотика, которая подавляет видимый рост исследуемого микроорганизма in vitro (в бульонных или на агаровых питательных средах) в стандартных условиях постановки опыта и выражается в мкг/мл (мг/л) или ед/мл. Минимальная бактерицидная концентрация (МБК) наименьшая концентрация антибиотика, которая при исследовании in vitro вызывает гибель 99,9% микроорганизмов от исходного уровня в течение определённого периода времени. Чувствительный микроорганизм штамм микроорганизма, который не имеет механизмов резистентности к данному препарату. Его его на питательной среде прекращается при использовании антибиотика в терапевтической дозе. Умеренно-резистентный микроорганизм штамм микроорганизма, рост которого на питательной среде прекращается только при использовании антибиотика в высшей дозе. Лечение инфекций, вызываемых умеренно-резистентными микроорганизмами, проводится при отсутствии альтернативных препаратов, высшей (максимальной терапевтической) дозой антибиотика. Резистентный микроорганизм штамм микроорганизма, который имеет механизмы резистентности к данному препарату. Его рост на питательной среде прекращается лишь при использовании очень высоких концентраций препарата, которые нельзя создать в организме из-за их высокой токсичности. При лечении инфекций, вызванных этим микроорганизмом, клинический эффект от терапии отсутствует даже при использовании высшей дозы антибиотика. При этом могут наблюдаться побочные действия антибиотика. ^
а) выделения микроорганизмов из первично стерильных жидкостей, органов и тканей человека; б) при выделении микроорганизмов из первично нестерильных биотопов, оценке чувствительности должна предшествовать оценка клинической значимости выделенного микроорганизма; в) инфекций, резистентных к препаратам эмпирической терапии; г) уникальных инфекций и отсутствии опыта их терапии; д) инфекций, требующих пролонгированной терапии (каждую неделю терапии проводят детекцию антибиотикорезистености, так как возможна смена возбудителей). ^
^ В исследования включают антибиотики, обладающие природной активностью в отношении выделенных микроорганизмов с клинически подтвержденной эффективностью при соответствующих инфекциях. В перечень антибиотиков могут быть включены 12 дополнительных препарата по запросу лечащего врача, либо при появлении новых более эффективных средств. ^
^ Характеристика метода. Полуколичественный. Определяет группы антибиотиков, активных в отношении патогена. Особенности метода. Используют стандартные диски диаметром 6,25 мм, представляющие собой фильтровальный картон, пропитанный антибиотиком в определенной концентрации. Техника проведения. Готовят суспензию тест-микроорганизмов в концентрации 1,5х108 КОЕ/мл, наносят ее в объеме 1 мл на чашку Петри со средой агар Мюллер-Хинтона или АГВ (толщина слоя среды 4±0,5 см). Суспензию распределяют равномерно по поверхности, избыток суспензии удаляют, поверхность среды высушивают, наносят на среду диски на расстоянии 2 см друг от друга и от края, но не более 6 на чашку Петри, инкубируют при 350С 18–24 часа. Можно использовать специальный диспенсер для одновременного нанесения 6 дисков. П  Рис. 45. Диаметр зоны задержки роста пропорционален антибиотикочувствитель-ности микроорганизма ринцип учета. Антибиотик из диска центробежно диффундирует в среду, в месте его действия микроорганизмы погибают, образуя концентрическую зону задержки роста. В остальных участках среды микроорганизмы беспрепятственно растут. Оценка чувствительности. Определяют диаметр зон задержки роста в мм и сравнивают со стандартными величинами зон задержки роста, на основании чего относят микроорганизмы к чувствительным, умеренно чувствительным или резистентным (рис. 45). Оценка метода. Простой, нетрудоемкий, относительно дешевый, обладает высокой воспроизводимостью. Основной метод в клинических лабораториях для нетребовательных микроорганизмов. ^ Характеристика метода. Количественный. Определяет активные препараты и их ингибирующие концентрации. Особенности метода. Готовят 812 серийных двукратных разведений антибиотика в агаре Мюллер-Хинтона. Техника проведения. Готовят суспензию тест-микроорганизмов в концентрации 107 КОЕ/мл и инокулируют по 12 мкл (посевная доза 12х104) на среды в чашках Петри с последовательными двукратными концентрациями антибиотика, инкубируют при 350С 18–24 часа. Культуры могут наносить на среду в чашках Петри штампом-репликатором, что позволяет одновременно изучать до 100 культур. Принцип учета. Микроорганизмы растут на среде, если концентрация антибиотика ниже ингибирующей и не растут если больше. Оценка чувствительности. Определяют МИК антибиотика для тест-культуры и сравнивают со стандартными величинами МИК. Относят тест-культуру к чувствительным, умеренно чувствительным или резистентным. Оценка метода. Метод трудоемкий, требует затрат большого количества сред, посуды, времени. Основной метод регионального или национального мониторинга антибиотикорезистнтности. ^ Характеристика метода. Количественный. Определяет активные препараты и их ингибирующие концентрации. Особенности метода. Готовят 812 серийных двукратных разведений антибиотика в пробирках с бульоном Мюллер-Хинтона. Техника проведения. Готовят суспензию тест-микроорганизмов 106 КОЕ/мл, вносят суспензию в соотношении 1:1 в Мюллер-Хинтон бульон с различными концентрациями антибиотика (посевная доза 5х105), инкубируют при 350С 18–24 часа. Принцип учета. Микроорганизмы растут на среде, вызывая ее помутнение, если концентрация антибиотика ниже ингибирующей, и не растут если больше (среда прозрачна). Оценка чувствительности. Определяют МИК тест-культуры и сравнивают со стандартными величинами МИК. Относят тест-культуру к чувствительным, умеренно чувствительным или резистентным. Оценка метода. Метод трудоемкий, требует затрат большого количества сред, посуды, времени. Основной метод регионального или национального мониторинга антиботикорезистнтности. ^ Характеристика метода. Количественный. Определяет активные препараты и их ингибирующие концентрации. Особенности метода. Используют стандартные пластиковые полоски с нанесенным на них экспоненциально убывающим градиентом концентрации антибиотика, например от 256 до 0,016 мкг/мл. Техника проведения. Готовят суспензию тест-микроорганизмов в концентрации 108 КОЕ/мл, погружают в нее стерильный тампон, равномерно штриховыми движениями распределяют суспензию по поверхности среды Мюллер-Хинтона или АГВ (рН 7,2±0,1), поверхность среды высушивают. На чашку диаметром 90 мм наносят не более 2 полосок E-теста (на чашку диаметром 150 мм не более 6), инкубируют при 350С 16–18 часов. Принцип учета. Антибиотик из Е-теста центробежно диффундирует в среду, в месте его активного действия рост микроорганизмов подавляется и образуется эллипсоидная (каплевидная) зона задержки роста. Так как концентрация антибиотика в полоске убывает, то получается не концентрическая, а эллипсоидная зона задержки роста. Место пересечения основания эллипса со шкалой концентраций E-теста соответствует МИК антибиотика (рис. 46).     Рис. 46. Метод Е-тестов Оценка чувствительности. Ингибиция роста микроорганизма вокруг полоски-носителя происходит только в той зоне, где концентрация антибиотика выше МИК. Определяют МИК тест-культуры и сравнивают со стандартными величинами МИК. Относят тест-культуру к чувствительным, умеренно чувствительным или резистентным. Оценка метода. Простой, не трудоемкий, позволяет тестировать привередливые микроорганизмы (стрептококки, пневмококки, гемофилы, гонококки, анаэробы). Не получил широкого распространения из-за дороговизны. ^ Характеристика метода. Полуколичественный или количественный. Позволяет получить результат через 4-6 часов. Основан на выявлении начальных стадий роста бактерий. Особенности метода. Используют индикаторы окислительно-восстановительного потенциала (ОВП) хлорид тетразолия или индикаторы рН среды (в том числе флюоресцентные), которые позволяют выявлять рост микроорганизмов на ранних стадиях. Техника проведения. Определение чувствительности проводят либо диско-диффузионным методом, либо методом разведений в бульоне (см. выше). При использовании диско-диффузионного метода через 46 часов агар с культурой и нанесенными дисками обрабатывают индикатором окислительно-востановительного потенциала хлоридом тетразолия. В случае использования метода разведений в бульоне изначально в жидкую среду с антибиотиками добавляют индикатор рН и сбраживаемые углеводы, при этом рН среды устанавливают нейтральной 7,2±0,2. За счет индикатора среда приобретает определенный цвет. Принцип учета. После обработки ОВП индикатором в местах роста микроба среда окрашивается в красный цвет, при отсутствии роста микроба цвет среды не изменяется. В случае использования индикатора рН, если антибиотик не активен, то микроорганизмы растут и выделяют кислые метаболиты, индиктор рН меняет цвет. Если антибиотик активен, то микроорганизмы погибают и среда не изменяет свой цвет. Оценка чувствительности. Оценка результатов проводится по диаметру неокрашенных зон вокруг дисков. В жидких средах по изменению цвета среды в пробирках определяют МИК антибиотика. Оценка метода. Простой, ориентировочный. Автоматизированнный метод с использованием автоматических микробиологических анализаторов Характеристика метода.  Рис. 47. Карта с лунками, заполненными дегратированными антибиотиками, углеводами, индикаторами рН Количественный. Определяет активные препараты и их ингибирующие концентрации, прогнозирует механизмы устойчивости, позволяет создавать компьютерную базу резистентности всех исследованных культур к антиботикам. Особенности метода. Используют стандартные тест-системы, в которых антибиотики в трех концентрациях внесены в специальные лунки пластиковой тест-системы. В лунках также находятся углеводы и индикатор рН. Все субстраты в лунках высушены. Техника проведения. Готовят суспензию чистой культуры тест-микроорганизмов с мутностью 0,250,65 по стандарту McFarland. Прибор вносит автоматически суспензию микроорганизмов в тест-систему, инкубирует при 350С в течение суток, учитывает каждые 2 часа результаты, по мере готовности результатов интерпретирует их в течение 2–24 часов, выдает протокол результатов (электронный, печатный). Принцип метода. Если концентрация антибиотика не активна, микроорганизмы растут и размножаются, вызывая увеличение мутности среды, снижение рН среды и изменение цвета индикатора. Если концентрация антибиотика активна, то микроорганизмы не изменяют мутность и цвет среды (рис. 47). Оценка чувствительности. Прибор автоматически проводит нефелометрию и спектрофотометрию и по изменению мутности и цвета среды определяет МИК тест-культуры. Сравнивает ее со стандартными величинами МИК и относит тест-культуру к чувствительным, умеренно чувствительным или резистентным штаммам. Оценка метода. Стандартный, из-за автоматизации прост в исполнении, позволяет получать результаты через 5–8 часов, позволяет создавать электронную базу данных и сравнивать данные из различных лабораторий. Требует дорогостоящего автоматического анализатора. ^ Характеристика методов. Определяют генетические маркеры резистентности. Особенности методов. Используют ПЦР, ПЦРПДРФ, ДНК-гибридизацию, секвенирование. Техника проведения. Выделяют ДНК из материала от больных или из чистой культуры микроорганизмов. Проводят генетические исследования. Проводят сравнение с данными фенотипического анализа. Принцип методов. У резистентных микроорганизмов присутствуют гены, контролирующие синтез ферментов, разрушающих антибиотики. У некоторых микроорганизмов резистентность связана с мутациями в генах, кодирующих структуры, на которые действует антибиотик. Изменение мишени приводит к резистентности (рис. 48). Оценка чувствительности. Выявление у микроорганизма генетических маркеров резистентности свидетельствует о потенциальной устойчивости к антибиотику. Оценка методов. Перспективны. На практике используются для диагностики антибиотикорезистентности микобактерий туберкулеза, а также для изучения генетических механизмов устойчивости в рамках регионального или национального мониторинга антибиотикорезистентности.  Рис. 48. Hain тест (реакция гибридизации на мембранах) для определения устойчивости к противотуберкулезным препаратам Mycobacterium spp. (на каждой тест-полоске верхние три горизонтальны полосы являются контролем, остальные свидетельствуют о видовой принадлежности и наличии мутаций в rpoB гене, обуславливающих устойчивость к рифампицину) Выявление генетических маркёров резистентности целесообразно в тех случаях, когда традиционные фенотипические методы определения чувствительности микроорганизмов неприменимы или недостаточно эффективны. Например, определение чувствительности Mycobacterium tuberculosis к противотуберкулёзным препаратам с помощью культуральных методов занимает 48 нед. Кроме того, результаты фенотипических тестов могут быть искажены в связи со снижением активности антимикробных препаратов в процессе длительного культивирования микроорганизмов. ^
содержание ионов Са2+ (не более 2025 мг/л) и Mg2+ (не более 1012,5 мг/л). Эти ионы инактивируют некоторые антибиотики (тетрациклины), при этом МИК антибиотика повышается; содержание тимина, тимидина, инактивирующих сульфаниламиды и триметоприм, рН среды (рис. 49).  Рис. 49. Влияние рН среды на диметры зон задержки роста некоторых антибиотиков
культуры, длительное время хранившиеся на плотных или жидких питательных средах, обладают пониженными ростовыми свойствами, поэтому для оценки чувствительности необходимо использовать микроорганизмы, инкубировавшиеся не более 1618 часов; увеличение концентрации инокулята с 105 КОЕ/мл до 107 КОЕ/мл может приводить к повышению МПК;
изменение температуры инкубации может привести к торможению либо к увеличению скорости роста, поэтому посевы инкубируют при 350С; преждевременный или поздний учет результатов может привести к ошибочной оценке результатов, поэтому учёт проводят через 1824 часа инкубации. ^
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям