^
Биохимическая идентификация основывается на определении ферментов микроорганизмов. Присутствие ферментов определяют по их способности разлагать соответствующие субстраты, для такой идентификации необходимо 18 – 24 часа. В последнее время определяют непосредственно сами ферменты, для такой идентификации требуется 4 – 6 часов.
Согласно международной биохимической классификации ферментов, в зависимости от катализируемой реакции выделяют 6 основных классов: оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лигазы. Отдельные представители каждого класса ферментов имеют систематическое название, традиционное (тривиальное) название, а также четырехуровневый числовой код, который отражает класс, подкласс, под-подкласс и серийный номер фермента в под-подклассе. Кроме систематического названия ферменты микроорганизмов имеют традиционные названия, получаемые в зависимости от субстратной специфичности. Традиционно ферменты микроорганизмов классифицируются на сахаролитические, протеолитические, липолитические, окислительно-восстановительные ферменты, а также ферменты-токсины, которые определяют с помощью специальных сред или тестов (табл. 10).
^
Фермент
|
Среда для детекции
|
Положительная реакция
|
^
|
Амилаза
|
Крахмальный агар (агар с 0,2% крахмала) и раствор Люголя.
|
При нанесении раствора йода на среду с 18 - 24 часовой культурой микроорганизмов, вокруг колоний с амилазной активностью образуется светлый неокрашенный ореол, в то время как остальная среда приобретает сине-фиолетовый цвет из-за присутствия в ней крахмала.
|
Карбо-гидразы
|
Дифференциально-диагностические среды для энтеробактерий (Эндо, Левина, Плоскирева и др.); содержат лактозу, анилиновые красители.
|
Лактозопозитивные энтеробактерии (Escherichia coli, Klebsiella oxytoca, K. pneumonia), образуют ярко окрашенные колонии,
лактозонегнативные энтеробактерии (Salmonella, Shigella) – бледно-розовые или бесцветные колоний.
|
Полиуглеводные среды (Клиглера, Олькеницкого и др.). Среда Клиглера имеет малиново-красный цвет и содержит: 0,1% глюкозы, 1% лактозы, соли Fe 2+, феноловый красный (индикатор рН).
|
При разложении глюкозы желтеет столбик среды, при разложении лактозы желтеет скошенная часть среды, при разложении углеводов с образованием CO2 в среде также появляются газовые пузырьки или разрыв столбика;
при образовании H2S наблюдается почернение по ходу укола.
|
Жидкие или полужидкие моноуглеводные среды Гисса; содержат один из углеводов, индикатор рН (табл. 5); рН среды устанавливают 7,2±0,2. Для выявления газообразования в жидкие среды вносят поплавок.
|
При разложении углеводов образуются кислые продукты, снижающие рН среды, в результате чего индикатор рН изменяет цвет. Газообразование на жидких средах приводит к накоплению газа в поплавке, в полужидких – появлению разрывов или газовых пузырьков в среде.
|
^
|
Выявляют с помощью реакции Фогес-Проскауэра, используют 10% КОН или 20% КОН.
|
После добавления к культуре равного объёма 10% или 20% КОН и инкубации 4-24 часа при 370С в случае образования ацетилметилкарбинола среда окрашивается в розовый цвет с жёлтым оттенком; в случае образования ацетоина и 2,3-бутиленгликоля окраска не изменяется.
|
^
|
Протеазы и пептидазы
|
5% обезжиренное молоко.
|
Происходит свёртывание с образованием сгустков казеина и пептонизация с лизис казеина, при которой молоко становится прозрачным. Обе реакции могут происходить последовательно или одновременно.
|
Свёрнутая сыворотка.
|
Происходит разжижение.
|
Столбик желатина.
|
Происходит разжижение (желатину разжижают ^ , Bacillus anthracis).
|
Молочный агар в чашках Петри имеет мутно-белый цвет.
|
Появляются зоны просветления вокруг колоний на фоне мутно-белой среды.
|
^
|
Среда с одной из аминокислот и индикатором рН;
рН среды 7,2±0,2.
|
Образуется аммиак, приводящий к защелачиванию среды и изменению цвета индикатора.
|
Декар-боксилазы
|
Среда с одной из основных аминокислот (аргинином, лизином, орнитином, гистидином, тирозином, глутамином) и индикатором рН.
|
При наличии декарбоксилазной активности среда подщелачивается за счёт образования диаминов, вызывая изменение цвета индикатора.
|
Трипто-фаназа
|
Мясо-пептонный бульон или среда с аминокислотой триптофаном, а также индикаторная бумажка, смоченная щавелевой кислотой и закреплённая под пробкой над питательной средой.
|
Образуется индол, который приводит к покраснению бумажки, смоченной щавелевой кислотой.
|
^
|
Среды с цистеином, метионином и качественным реактивом на H2S – солями железа, свинца, висмута.
|
Образуется H2S, который взаимодействует с Fe2+(Pb2+, Vi2+) с образованием сульфида железа черного цвета, что вызывает почернение среды.
|
Уреаза
|
Среда с мочевиной и индикатором рН феноловым красным, рН среды устанавливают 6,8±0,2.
|
Образуется аммиак и окраска среды из красно-оранжевой переходит в малиново-лиловую за счёт сдвига рН в щелочную сторону.
|
^
|
Липаза
|
Желточный агар или среда с твином-80.
|
Липазы гидролизуют жиры на глицерин и свободные жирные кислоты. Вокруг колоний в проходящем свете на поверхности среды видна радужная пленка (похожа на бензиновую пленку на поверхности воды).
|
Лецити-наза
|
Желточный агар (к 300 мл стерильного МПА, расплавленного и охлажденного до 45-500С, добавляют источник лецитина желток куриного яйца).
|
Лецитиназа расщепляет лецитин на фосфохолин и диглицерид, и вокруг колоний появляются опалесцирующие зоны, или «венчики помутнения»; лецитиназа есть у Staphylococcus aureus, клостридий, фузобактерий.
|
^
|
Оксидаза
|
Фильтровальная бумага, смоченная свежеприготовленным 1% раствором тетраметилпарафенилен-диамина (реактив на оксидазу).
|
При нанесении бакпетлей 18-24 часовой культуры на поверхность фильтровальной бумаги в течение 1 мин появляется пурпурно-фиолетовое окрашивание; используют для дифференциации Pseudomonas spр. (оксидазопозитивные) и энтеробактерий (оксидазонегативные).
|
Каталаза
|
3% раствор Н2О2; присутствие каталазы определяют у микроорганизмов, выращенных на любой питательной среде, кроме кровяных сред.
|
При нанесении на колонию перекиси водорода, либо при внесении культуры в каплю перекиси на предметном стекле появляются пузырьки газа; используют для дифференциации Streptococcus spр. (каталазопозитивные) и Staphylococcus spp. (каталазонегативные).
|
Дегид-разы
|
Сахарный полужидкий агар (донор водорода) с 1% метиленовым синим (акцептор водорода).
|
Дегидразы способны восстанавливать некоторые органические красители, поэтому метиленовый синий обесцвечивается. Используют для определения бактериальной обсеменённости молока: подкрасив молоко метиленовой синькой, определяют время его обесцвечивания. Чем оно меньше, тем более обсеменено молоко. Качественное молоко долго остаётся синим.
|
Перокси-даза
|
Используют бензидиновый тест: на предметное стекло наносят 4-6 капель суточной бактериальной культуры добавляют по 1-3 капли 2 % раствора метилпарааминофенол сульфата и 3% раствора Н2О2.
|
В течение 5 – 10 мин бесцветная среда приобретает розовую или вишнёво-красную окраску. Положительная реакция характерна для Staphylococcus spp., отрицательная - Pseudomonas spp., Escherichia spp.
|
ФЕМЕНТЫ-ТОКСИНЫ
|
Гемо-лизины
|
510% кровяной агар.
|
-гемолизины приводят к неполному гемолизу с образованием вокруг колоний зоны неполного просветления среды, которая в течение 2-5 суток приобретает зеленовато-бурый оттенок.
-гемолизины вызывают полный гемолиз с образованием прозрачной зоны вокруг колоний.
-гемолизины не дают видимого глазом гемолиза.
|
О-стрепто-лизин
|
В пробирки с двукратными разведениями -гемолитических стрептококков добавляют равный объем 5% эритроцитов кролика, инкубируют при 370С 1 час; параллельно ставят контроль из взвеси эритроцитов в питательном бульоне.
|
В положительных случаях происходит гемолиз (лаковая кровь), в отрицательных случаях образуется осадок из эритроцитов.
Определяют титр О-стрептолизина - наибольшее разведение микробной культуры при котором наблюдается гемолиз.
|
Плазмо-коагулаза
|
Стерильная цитратная плазма крови, разлитая по 0,4 мл в пробирки.
|
После внесения суточной агаровой культуры и инкубации посевов 25 часов при 370С происходит свёртывание плазмы и утрата ею текучести.
|
Гиалуро-нидаза
|
Побирка с гиалуроновой кислотой и уксусная кислота; при добавлении к гиалуроновой кислоте уксусной кислоты образуется сгусток муцина.
|
Если тест-культура образует гиалуронидазу, то после 15 мин инкубации культуры бактерий при 370С в пробирке с гиалуроновой кислотой и добавления 23 капель уксусной кислоты образуется сгусток муцина.
|
Нуклеазы
|
МПА с ДНК, среда опалесцирует (полупрозрачна).
|
Через 1824 часа культивирования на среде после нанесения на ее поверхность 0,1% H2SO4 из-за деполимеризации ДНК и РНК вокруг колоний образуется прозрачный ореол «венчик просветления».
|
^
|
Сгустки фибрина.
|
Растворение сгустков фибрина.
|
Цито-токсины
|
Культура эпителиальных клеток или др. и токсин, выделенный путем фильтрования культуральной жидкости с использованием бактериальных фильтров.
|
При культивировании культуры клеток с безмикробным фильтратом токсина культура клеток утрачивает типичную тканевую морфологию: округляется, ядра пикнотизируются.
|
^
|
Газо-жидкостная хроматография кислото-эфирного экстракта ЛЖК из биологического материала или культуральной жидкости, содержащей анаэробы.
|
На хроматограмме появляются пики в зависимости от массы и полярности вещества: чем легче вещество, тем раньше появляется пик на хроматограмме, поэтому ЛЖК выходят в следующей последовательности: уксусная, пропионовая, масляная, валериановая, капроновая (рис. 25). Изомасляная, изовалериановая, изокапроновая кислоты выходят раньше соответствующей кислоты.
|
Р
^
Изовалериановая кислота
Масляная кислота
Изомасляная кислота
Пропионовая кислота
Уксусная кислота
 ис. 25. Хроматограмма выхода ЛЖК, отражающая зависимость времени выхода стандартного раствора смеси летучих жирных кислот от их молекулярной массы и полярности (чувствительность электрометра 110 – 9)
|
В последние годы в бактериологических лабораториях применяются одноразовые коммерческие тест-системы для биохимической идентификации. Они представляют собой пластиковые планшеты с лунками, заполненными дегидратированными субстратами с индикатором рН. Тест-системы позволяют изучать 20, 32, 64 биохимических признака (рис. 26).
^ :
выделение чистой культуры или изолированных колоний на плотной питательной среде;
приготовление бактериальной суспензии с определенной концентрацией микроорганизмов, которую определяют путем сравнения со стандартами мутности;
Рис. 26. Коммерческие тест-системы
внесение суспензии микроорганизмов в лунки тест-системы;
инкубация в термостате от 4 до 24 часов (длительность зависит от тест-системы) при 370С;
учёт результатов, который может быть:
а) визуальным по изменению цвета индикатора;
б) автоматическим с использованием микробиологического анализатора.
анализ результатов с использованием компьютерного банка данных, включающего биохимические профили разных видов микроорганизмов. Результаты ферментации учитываются по принципу +/- и вносятся в референс-таблицу, после чего происходит сравнение с компьютерным банком данных. Идентифицируемый микроорганизм относят к тому виду, с которым он проявляет наибольшее сходство и указывают степень сходства (в %). Хорошей идентификацией считается идентификация с 95% (и более) совпадением признаков.
^
БЕЗ ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ
Идентификация без выделения чистой культуры микроорганизмов необходима для детекции возбудителей непосредственно в биологическом материале, что позволяет проводить экспресс-диагностику заболеваний, а также выявлять некультивируемые микроорганизмы. Используют два подхода: генетический и серологический.
^ Применяют молекулярно-генетические методы (ПЦР, гибридизацию, секвенирование). Являются перспективными для идентификации любых микроорганизмов и определения устойчивости к противомикробным препаратам (бактерий, вирусов), что обусловлено крайне высокой чувствительностью и быстротой получения результатов. Широко используют для идентификации длительно культивируемых бактерий (микобактерии туберкулёза), облигатных внутриклеточных паразитов (хламидий), возбудителей менингитов, а также вирусов (ВИЧ и вирусов гепатитов). Предполагается, что в будущем эти методы станут основными в диагностике.
^ Применяют высоко специфические серологические реакции: РИФ, ИФА. Наибольшее распространение данное направление получило для:
а) идентификации в РИФ некоторых возбудителей заболеваний, передаваемых половым путём (хламидии, микоплазмы, уреаплазмы);
б) идентификации в ИФА антигенов вируса гепатита В и антигенов ВИЧ.
^
В конце 90-х годов XX века в диагностике инфекционных заболеваний ведущее место заняли молекулярно-генетические методы исследования, основанные на изучении биомолекул ДНК, РНК, белков в составе клеток (табл. 10). Они расширили представления:
– о структуре и регуляции функций живого;
– о происхождении микроорганизмов и их эволюции;
– о молекулярном патогенезе заболеваний;
– о возможности диагностики и лечения заболеваний.
^
Диагностика инфекционных заболеваний. Маркёром возбудителя является его геном, а именно видоспецифические генетические участки, по которым определяют присутствие определенного вида микроорганизма в клиническом материале (идентифицируют микроорганизмы). Например, IS 6110 есть только у микобактерий туберкулеза, поэтому выявление IS 6110 дает прямое указание на присутствие возбудителя туберкулеза.
Химиотерапия и химиопрофилактика инфекционных заболеваний. Молекулярно-генетические методы широко используются для выявления маркеров резистентности генов резистентности, либо мутаций в генах. Определение устойчивых к b-лактамным антибиотикам стафилококков проводят по наличию в их геноме гена mecA, энтеробактерий (E. coli и K. pneumoniae) и Pseudomonas aeruginosa – по генам tem, shv, oxa. Выявление резистентности к рифампицину у Mycobacterium tuberculosis проводят по мутациям в rpoB гене.
Санитарная микробиология. Молекулярно-генетические методы позволяют выявлять инфекционные агенты в пищевых продуктах, тем самым контролировать их качество, или расследовать причину пищевых отравлений. Эти методы позволяют определять генетически модифицированные пищевые продукты, а также проводить детекцию инфекционных агентов в окружающей среде.
Эпидемиология и инфекционный контроль. С помощью молекулярно-генетических методов определяют различия микроорганизмов одного вида (типируют микроорганизмы), выделенных от разных больных, в разных стационарах, в разных географических регионах. Это позволяет определять источники возбудителя, пути его распространения в стационаре, стране, мире и разрабатывать меры, контролирующие распространение эпидемических клонов.
Биотехнология, в том числе вакционология. С помощью молекулярно-генетических методов создают генетически модифицированные организмы с полезными для народного хозяйства свойствами. В последнее время в вакцинологии получил широкое распространение подход, называемый «обратной вакционологией». В классической вакцинологии основными объектами исследования являлись микроорганизмы-возбудители, которых инактивировали или лишали вирулентности, а затем микроорганизм или его компоненты использовали для вакцинации. В обратной вакцинологии основным объектом исследования является секвенированный геном микроорганизма, в котором с использованием компьютерного анализа проводят поиск генов (in silico анализ), кодирующих антигены микроорганизмов. Эти гены клонируют в геном E. coli или других неприхотливых микроорганизмов, которые начинают продуцировать «клонированные» белки, иммунногеные свойства которых изучают путем иммунизации мышей. Наиболее иммуногенные пептиды становятся кандидатами в вакцины и проходят дальнейшие клинические испытания. Такой подход использован для создания вакцин, в разработке которых с использованием классических методов испытывали сложности – против менингококков, стрептококков (Streptococcus pneumoniae), хламидий (Chlamydophila pneumoniae), стафилококков, иерсиний (Yersinia pestis), порфирормонад (Porphyromonas gingivalis), плазмодиев малярии (Plasmodium falciparum).
Систематика и эволюция микроорганизмов. Молекулярно-генетические методы позволяют создать естественную систематику микроорганизмов, отражающую их эволюционные взаимосвязи.
Геномика и патогеномика. При помощи молекулярно-генетических методов расшифровывают структуры и функций геномов, протеомов, внутриклеточных метаболитов, изучают молекулярный патогенез инфекционных заболеваний.
^ Тип исследуемого материала зависит от симптомов, патогенеза, эпидемиологии предполагаемого заболевания. Для молекулярно-генетических исследований используется такой же материал, как и для бактериологического исследования:
– клинический биологический материал от больного (кровь, смывы, соскобы, слюна, гной, мокрота, спинномозговая жидкость, желудочный сок, отделяемое из уретры, моча, испражнения, биоптаты тканей и органов),
– пробы из объектов внешней среды (пищевые продукты, вода, почва),
– чистые культуры микроорганизмов.
Вид материала определяется методом, который будет использован для выделения ДНК/РНК.
Этапы молекулярно-генетических исследований.
1. Взятие материала, маркировка, транспортировка, подготовка проб к исследованию, хранение.
2. Экстракция ДНК/РНК.
3. Проведение молекулярно-генетических исследований.
4. Анализ и интерпретация результатов, выдача заключения.
^
Классификационный признак
|
Принципы методов
|
Методический подход
|
изучение фрагментов ДНК
гибридизация нуклеиновых кислот
амплификация нуклеиновых кислот
анализ амплифицированных фрагментов
определение последовательности нуклеотидов в ДНК, РНК и аминокислот в белках
модификация генетической информации
|
Цель
|
идентификация микроорганизмов
типирование микроорганизмов
эволюционный и филогенетический анализ микроорганизмов
определение положения и функций генов микроорганизмов
изучение экспрессии генов
|
Методы, основанные на изучении фрагментов ДНК.
Плазмидное типирование (рис. 27, 28). При помощи специальных методов из бактерий выделяют плазмидную ДНК и проводят разделение плазмид в агарозном геле. Перед проведением электрофореза плазмидную ДНК можно обработать рестриктазами, что приводит к фрагментированию ДНК. Метод позволяет оценить количество плазмид, их размер, а также характер образуемых рестрикционных фрагментов. Плазмидный анализ широко используется в эпидемиологических исследованиях, особенно при расследовании вспышек заболеваний, вызванных такими микроорганизмами, как Staphylococcus spp., P. aeruginosa, представителями семейства Enterobactereaceae. Однако многие клинические штаммы способны терять плазмиды, особенно в процессе многочисленных пересевов в лаборатории.
1 2 3 4 5 6 7 8
Рис. 28. Установление идентичности Salmonella typhimurium, выделяемых от разных пациентов, по присутствию у них одинаковых плазмид (во время вспышки пищевого отравления от больных выделяли сальмонеллы с одинаковыми плазмидами размером 2900 п. о. (образцы 2, 3, 4, 7, 8)
   
1
1
2
3
3
4
4
4
4
5
6
7
8
8
8
8
9
Рис. 27. Рестрикционные профили плазмид, выделяемых у разных штаммов сальмонелл
(рестрикция с помощью эндонуклеазы BglII плазмиды blacmy-2 позволяет выявить 9 типов плазмид и распределить сальмонеллы на подтипы)
Рестрикционно эндонуклеазный анализ (REA). Бактериальную хромосому нарезают рестриктазами на множество фрагментов. Затем проводят электрофорез в пульсирующем электрическом поле, в результате которого фрагменты ДНК выстраиваются в зависимости от размера в шеренгу, образуя уникальный видоспецифический профиль (рис. 29).
Рис. 29. Рестрикционно эндонуклеазный анализ ДНК Staphylococcus spp.
По сходству рестрикционных профилей изучаемого и известных видов микроорганизмов можно идентифицировать и типировать микроорганизмы. Обычно для рестрикции используют макрорестриктазы – ферменты, распознающие участки, состоящие из 6 или более нуклеотидов (табл. 12). Такие участки распознавания присутствуют в геноме в небольшом количестве, поэтому в результате действия макрорестриктаз образуется до 30 достаточно крупных фрагментов. С помощью данного метода анализируется около 90% бактериальной хромосомы. С помощью компьютеризированной системы сканирования гелей могут быть созданы базы данных ретрикционных профилей для многих микроорганизмов.
^
-
-
Типы рестриктаз
|
Рестриктаза
|
Сайт распознавания
|
Макрорестриктазы, распознающие последовательности из 6 и более нуклеотидов
|
SmaI
|
5'...C C C^G G G...3'
3'...G G G^C C C...5'
|
SalI
|
5'...G^T C G A C...3'
3'...C A G C T^G...5'
|
XbaI
|
5'...T^C T A G A...3'
3'...A G A T C^T...5'
|
Стандартные рестриктазы
|
HaeIII (BsuRI)
|
5'...G G^C C...3'
3'...C C^G G...5'
|
Примечание. ^ - место рестрикции.
^
Молекулярная гибридизация - молекулярно-биологическая техника, основанная на способности одноцепочечной молекулы изучаемой ДНК/РНК специфически соединяться с комплементарными одноцепочечными зондами (молекулами-свидетелями) с образованием гибридных дуплексов, которые флюоресцируют или меняют цвет реакционной смеси.
Методы молекулярной гибридизации позволяют выявлять степень сходства двух молекул ДНК, что используется для эволюционного анализа, для идентификации и типирования микроорганизмов, а также для изучения экспрессии генов.
Варианты проведения молекулярной гибридизации.
В растворе.
В тканевых срезах (in situ). Тканевые срезы депарафинируют, демаскируют нуклеиновые кислоты в них и наносят гибридизационный раствор, содержащий специфические меченые зонды. Проводят денатурацию ДНК, гибридизацию, отмывку несвязавшихся зондов, после чего осуществляют детекцию гибридизировавшихся зондов по флюоресценции.
На микрочипах (эррей гибридизация) – наиболее совершенный метод. Позволяет наносить и фиксировать до нескольких сотен тысяч ДНК-зондов на поверхность стеклянного чипа, что дает возможность изучать одновременно все гены, присутствующие в ДНК микроорганизма.
^ Изучаемую ДНК фиксируют на мембранах и к ней добавляют гибридизационный раствор, содержащий специфические меченые зонды. В случае комплементарности зонд связывается с ДНК, после отмывки несвязавшихся зондов регистрируют флюоресценцию.
^
А. Выделение ДНК. Методы аналогичны методам выделения ДНК для проведения ПЦР.
Б. Получение мелких фрагментов изучаемой ДНК (не более 5000 – 10000 п. о.). Для этого проводят либо рестрикцию (нарезку рестриктазами) крупной молекулы ДНК, либо ПЦР с образованием небольших ампликонов, либо обработку ультразвуком.
В. Нанесение ДНК на мембрану и фиксация ДНК на мембране:
– дот-блоты или слот-блоты. Перед нанесением ДНК денатурируют – превращают в одноцепочечные молекулы. Затем небольшие фрагменты изучаемой ДНК наносят на мембрану в виде точек (дот-блоты), либо полосок (слот-блоты).
– саузерн-блоты. Небольшие фрагменты изучаемой ДНК предварительно разделяют электрофорезом в полиакриламидном геле. ДНК переносят из геля на поверхность мембран.
Перенесенную на мембрану ДНК фиксируют при 800С или УФ светом.
Г. Гибридизация проводится в несколько этапов:
– обработка предгибридизационным буфером мембраны с ДНК, что увеличивает связывающую способность мембраны;
– приготовление гибридизационного раствора, содержащего буфер и меченый зонд;
– программирование гибридизационной камеры и проведение гибридизации при 650С.
Д. Анализ результатов. Если зонд комплементарен одноцепочечному участку ДНК изучаемого микроорганизма, происходит связывание зонда и исследуемой ДНК. Некомплементарные несвязавшиеся зонды удаляют промыванием. В месте связывания зонда выявляют флюоресценцию или изменение цвета (рис. 30).
 
Рис. 30. Схема реакции молекулярной гибридизации для обнаружения в образцах ДНК возбудителя специфическим меченным зондом
^
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) была разработана в 1983 г. американским биохимиком Кэри Мюллисом, который в 1993 г. был удостоен за это открытие Нобелевской премии.
Метод ПЦР основан на принципе естественной репликации ДНК и заключается в получении множественных копий (ампликонов) ДНК размером до 5000 п. о.
В качестве амплифицируемых участков ДНК микроорганизмов могут выступать гены патогенности, жизненно важных функций (гены «домашнего хозяйства»), устойчивости к противомикробным препаратам, видо- и родоспецифичные гены (важны для идентификации).
^ После температурной денатурации двухцепочечной ДНК образуются одноцепочечные молекулы, к которым присоединяются небольшие олигонуклеотиды – праймеры. Праймеры присоединяются только к комплементарному участку ДНК на обоих цепях ДНК и ограничивают амплифицируемый фрагмент с двух сторон. К 3’концу праймера прикрепляется ДНК-полимераза и на ДНК-матрице синтезирует копию. Синтез ДНК протекает только между праймерами.
Каждая стадия происходит при определенной температуре (рис. 31).
Рис. 31. Схема полимеразной цепной реакции
Каждый вновь синтезируемый фрагмент ДНК служит матрицей для синтеза двух новых нитей в следующем цикле амплификации. При многократном (30-40 раз) повторении этих стадий и оптимальном сочетании компонентов реакционной смеси происходит экспоненциальное увеличение количества ампликонов до 2n, где n - число циклов амплификации. Детекцию образуемых ампликонов проводят с использованием электрофореза, либо флюоресцирующих зондов, либо флюоресцирующего ДНК-красителя SybrGreen. Получающиеся ампликоны имеют определенный размер, равный количеству олигонуклеотидных пар амплифицируемой последовательности и праймера.
^ проводится в 5 этапов.
1
Рис. 32. Экстракция ДНК
этап. Выделение (экстракция) ДНК из клеток(рис.32). Метод выделения ДНК зависит от изучаемого микроорганизма и вида материала для исследований.
На этой стадии клетки лизируют одним из способов: а) ферментативно (лизоцим); б) химически; в) термически (90 – 950С). Клеточный дебрис осаждают центрифугированием, при этом ДНК остается в растворе. В некоторых случаях возникает необходимость в концентрировании ДНК. Для этого находящуюся в растворе ДНК адсорбируют на сорбенте, а затем проводят десорбцию ДНК небольшим количеством элюента. Концентрируют ДНК также с использованием осаждающих ДНК веществ, после чего осевшую ДНК ресуспендируют в небольшом объеме воды.
2 этап. Приготовление реакционной смеси. В микроцентрифужных пробирках объемом 0,5 или 0,2 мл смешивают компоненты реакционной смеси так, чтобы объем общей реакционной смеси составлял 25, 50 или 100 мкл. Все компоненты реакции вносят микропипеткой, причём каждый раз наконечник микропипетки меняют во избежание контаминации.
Обязательные компоненты реакционной смеси:
а) раствор искомой ДНК, выделенной на предыдущей стадии;
б) смесь четырёх дНТФ (дезоксинуклеотидтрифосфатов) строительный материал ДНК;
в) термостабильная ДНК-полимераза Taq-полимераза (не денатурирует при 960С), осуществляющая полимеризацию нуклеотидов; ее получают из
термофильных микроорганизмов ^
г) два синтетических праймера (прямой и обратный) короткие, длиной 15 30 оснований, одноцепочечные олигонуклеотиды, которые связываются с комплементарными структурами исследуемой ДНК и с которых начинается биосинтез множественных копий;
д) специфический буфер. Для функционирования Taq-полимеразы необходимы ионы Mg+2, определённые значение рН и концентрации солей.
Необязательным компонентом являются присадки, увеличивающие специфичность реакции.
Рис. 33. Термоциклер
3. Программирование температурного цикла и проведение амплификации заданного фрагмента ДНК в термоциклере (рис.33). На выделенной ДНК-матрице происходит процесс многократного копирования ДНК в ходе последовательно сменяющихся циклов. Пробирки с реакционной смесью размещают в приборе термоциклере. Температурные режимы циклов в термоциклере изменяются в соответствии с заданной программой. Программа проведения ПЦР включает 4 стадии (табл. 13).
Таблица 13
|
