Учебно-методическое пособие Минск бгму 2010 удк
|
|
Скачать 1.83 Mb.
|
Рис. 23. Индикаторная среда Клиглера:
1 – исходная,
2 – с ростом E. coli,
3 – с ростом S. paratyphi B,
4 – с ростом S. typhi
E. coli разлагают глюкозу и лактозу с газообразованием, не продуцируют сероводород. Они вызывают пожелтение столбика и скошенной части с разрывами среды.
S. paratyphi разлагают глюкозу с газообразованием, лактозоотрицательны. Они вызывают пожелтение столбика с разрывами, скошенная часть не изменяет цвет и остается малиновой. При этом S. paratyphi B продуцируют сероводород (по ходу укола появляется черная окраска), S. paratyphi A сероводород не продуцируют.
S. typhi разлагают глюкозу без газообразования, лактозоотрицательны, продуцируют сероводород. Они вызывают пожелтение столбика без разрывов, скошенная часть не изменяет цвет и остается малиновой, по ходу укола появляется черная окраска.
Shigella spp. глюкозопозитивны, лактозоотрицательны, не продуцируют сероводород. Они вызывают пожелтение столбика (с разрывами или без них в зависимости от серовара), скошенная часть не изменяет цвет и остается малиновой.
Б. Окончательная идентификация чистой культуры (определение систематического положения выделенного микроорганизма до уровня вида или варианта) и определение спектра чувствительности выделенной культуры к антибиотикам.
Для идентификации чистой культуры на этом этапе изучают биохимические, генетические, серологические и биологические признаки (табл. 8).
В рутинной лабораторной практике при идентификации нет необходимости изучать все свойства. Используют информативные, доступные, простые тесты, достаточные для определения видовой (вариантной) принадлежности выделенного микроорганизма.
|
^
Микробиологические исследования анаэробных микроорганизмов отличаются от выделения других типов микроорганизмов, так как облигатно анаэробные микроорганизмы погибают при содержании О2 в атмосфере более 0,1%. Несоблюдение правил культивирования анаэробных микроорганизмов может привести к выдаче неправильного ответа («гной стерилен») или к потере анаэробов в процессе культивирования. Впервые облигатные анаэробы Сlostridium butiricum выделил Л. Пастер в конце 19 века. С тех пор для выделения анаэробных микроорганизмов использовали разнообразные методы. Но из-за их нестандартности, плохой воспроизводимости многие из традиционных методов в современной бактериологии не применяются, уступив место более совершенным и стандартным методам. ^
б) содержать, при необходимости, стимулирующие добавки: бараньи эритроциты (5%), лошадиную сыворотку (5-10%), твин-80 (0,02%); пируват натрия (0,9%); глюкозу (0,5%); L – аргинин (0,1%); в) иметь низкий окислительно-восстановительный потенциал, что достигается путем добавления редуцирующих веществ. Редуцирующий агент, связывая свободный кислород среды, снижает Eh среды. В качестве нетоксичных редуцирующих агентов, обеспечивающих восстановительные условия среды, используют цистеина гидрохлорид (0,025%), тиогликолят натрия (0,05%), дитиотрейтол (0,05%). В некоторые среды (Китта-Тароцци) добавляют кусочки тканей паренхиматозных органов (легкие, печень); д) содержать селективные добавки, что обеспечивает избирательное выделение облигатно анаэробных микроорганизмов. В качестве селективных добавок используют антибиотики аминогликозидного ряда, к которым анаэробы природно устойчивы. Для выделения облигатно анаэробных микроорганизмов используют следующие среды: - анаэробный кровяной агар с гентамицином, - анаэробный кровяной агар с неомицином и налидиксовой кислотой, - анаэробный кровяной агар с канамицином и ванкомицином, - фруктозо-циклосерин-цефокситиновую среду (для Clostridium difficile), - тиогликолевую полужидкую среду, - среду Китта-Тароцци (жидкая среда с кусочками мяса и вазелиновым маслом на поверхности), - среду Вильсона-Блера (железо-сульфитный агар). Clostridium spp. растут в глубине столбика этой среды, давая колонии чёрного цвета за счёт восстановления сернокислого натрия в сульфат натрия, который, соединяясь с хлорным железом, образует чёрный осадок сернистого железа.
а  Рис. 21. Анаэробная камера ) Анаэробная камера (рис. 21) представляет собой герметичный прозрачный бокс, перчаточный или бесперчаточный. Анаэробные условия в нем достигаются созданием вакуума с последующим заполнением пространства камеры анаэробным газом трехкомпонентным (N2 (85%– 90%) + CO2 (5–10%) + Н2 (5%)) или двухкомпонентным (N2 + Н2). Устройство оснащено шлюзом для подачи из агрессивной кислородсодержащей среды во внутреннее пространство камеры образцов и расходных материалов. В камере также есть термостат, устройство для поддержания и контроля влажности, палладиевый катализатор для удаления остаточных количеств кислорода, прибор контроля концентрации кислорода. Анаэробная камера – дорогостоящее оборудование, им оснащаются преимущественно диагностические центры республиканского значения, рефференс-центры. Обеспечивает наивысшее качество анаэробного культивирования. Отличается вместительностью (50–200 чашек Петри), все диагностические исследования выполняются в бескислородной атмосфере. б) Микроанаэростат (рис. 22) представляет собой цилиндрическую, герметично закрываемую металлическую или пластмассовую емкость объемом 2,5 (3–7) литров, используемую для инкубации посевов в анаэробных условиях. Б   Рис. 22. Микроанаэростаты ескислородные условия в микроанаэростате создаются одним из двух способов: 1) вакуумзамещением создают вакуум и заполняют анаэробным газом; 2) химическим связыванием кислорода. Для химического связывания кислорода используют газогенерирующие системы, которые после добавления воды генерируют Н2 и СО2. Н2 связывает в присутствии палладиевого катализатора свободный кислород с образованием воды. Генерируемый СО2 необходим для стимуляции роста анаэробов, являющихся капнофилами. В последнее время используют системы, связывающие кислород за счет окисления соединений железа. Создание бескислородных условий в микроанаэростатах контролируется индикаторной тест-полоской, импр егнированной метиленовой синью, которая обесцвечивается в случае образования бескислородной атмосферы. Вместимость микроанаэростатов составляет 10–12 чашек Петри. Все исследования проводят в кислородсодержащей атомосфере, а затем загружают посевы в микроанаэростат, что снижает качество диагностических процедур по сравнению с анаэробной камерой. Кроме того, отсутствует возможность неограниченного наблюдения за посевами в процессе инкубации. Микроанаэростаты используют в малых лабораториях, они позволяют получить удовлетворительные результаты. в) Анаэробный пакет представляет собой прозрачный, герметично закрываемый пластиковый пакет, рассчитанный на 1–2 чашки Петри. Анаэробные условия в нем создаются химическим связыванием кислорода с безводной реакционной системой. Создание бескислородных условий также контролируется индикаторной тест-полоской, обесцвечивающейся в бескислородной атмосфере. Анаэробные пакеты удобны для транспортировки материала, культур анаэробов, в экстренных случаях, в полевых условиях, а также в лаборатории при малой диагностической нагрузке. Прозрачность полиэтиленовых мешков позволяет легко проводить периодический контроль роста микроорганизмов. Анаэробные пакеты позволяют получить удовлетворительные результаты. ^ Метод Вейнберга. Готовили последовательные разведения материала в изотоническом растворе и высевали их в пробирки с расплавленным и остуженным до 40-450С сахарным агаром или средой Вильсон-Блера. Клостридии росли в виде черных колоний в толще среды. Метод Виньяля-Вейона. Исследуемым материалом, разведенным в расплавленной и остуженной до 40-450С среде Вильсона–Блера, заполняли капилляры пастеровских пипеток, концы которых запаивали и помещали в стеклянный цилиндр с ватой на дне. Через 2-3 сут в столбике агара вырастали колонии анаэробов, которые легко изолировали, надломав капилляр выше уровня намеченной колонии. Изолированные колонии извлекали петлёй, пересевали, изучали свойства с целью идентификации. Химический способ культивирования анаэробов в эксикаторах (метод Аристовского). Посевы исследуемого материала в чашках Петри помещали в эксикатор - стеклянные емкости с притертыми краями крышки. На дно эксикатора вносили химический поглотитель кислорода: гипосульфит натрия или пирогаллол, и углекислый натрий. Биологический способ культивирования анаэробов (метод Фортнера), или метод совместного культивирования анаэробов и аэробов на плотных питательных средах в запаянных чашках Петри. На поверхность среды в чашках Петри (5% кровяной агар с 1-2% глюкозы), разделенной на две половины желобком, высевали на одной половине культуру активно поглощающих кислород аэробов (S. marcescens или E. coli), на другой половине – исследуемый материал. Чашки запаивали воском или заклеивали лейкопластырем. Аэробные бактерии быстро использовали кислород в герметически закрытой чашке, что создавало условия для роста анаэробов. Метод позволял выделять некоторые Clostridium spp. ^ Бактериологический метод исследования (БЛМИ) – метод, основанный на выделении чистых культур бактерий с помощью культивирования на питательных средах и их идентификации до вида на основании изучения морфологических, культуральных, биохимических, генетических, серологических, биологических, экологических характеристик микроорганизмов. Бактериологическую диагностику инфекций проводят, используя стандартные диагностические схемы, утвержденные Министерством здравоохранения. Чистая культура – бактерии одного вида, выращенные на питательной среде, свойства которых находятся в процессе изучения. Штамм – идентифицированная чистая культура микроорганизмов одного вида, выделенная из определенного источника в определенное время. Штаммы одного вида могут несущественно отличаться биохимическими, генетическими, серологическими, биологическими и др. свойствами, а также местом и временем выделения. Цели БЛМИ: 1. Постановка этиологического диагноза: выделение чистой культуры микроорганизмов и её идентификация. 2. Определение дополнительных свойств, например, чувствительности микроорганизма к антибиотикам и бактериофагам. 3. Определение количества микроорганизмов (важно в диагностике инфекций, вызываемых УПМ). 4. Типирование микроорганизмов, т. е. определение внутривидовых различий на основании изучения генетических и эпидемиологических (фаговаров и сероваров) маркёров. Это используется в эпидемиологических целях, т. к. позволяет установить общность микроорганизмов, выделяемых от разных больных и из разных объектов внешней среды, в различных стационарах, географических регионах. ^ различных для аэробов, факультативных анаэробов и облигатных анаэробов. I. Этапы БЛМИ при выделении чистой культуры аэробов и факультативных анаэробов. 1 этап. А. Забор, транспортировка, хранение, предварительная обработка материала. Иногда до посева проводят селективную обработку материала с учетом свойств выделяемого микроорганизма. Например, перед исследованием мокроты или другого материала на присутствие кислотустойчивых микобактерий туберкулеза, материал обрабатывают растворами кислот или щелочей. Б. Посев в среду обогащения (при необходимости). Его проводят, если в исследуемом материале содержится малое количество бактерий, например, при выделении гемокультуры. Для этого кровь, взятую на высоте лихорадки в большом объёме (8–10 мл у взрослых, 4–5 мл у детей) засевают в среду в соотношении 1:10 (для преодоления действия бактерицидных факторов крови); посев инкубируют при температуре 370С 1824 ч. В. Микроскопия исследуемого материала. Из исследуемого материала готовят мазок, окрашивают его по Граму или другим методом и микроскопируют. Оценивают присутствующую микрофлору, ее количество. В ходе дальнейших исследований должны быть выделены микроорганизмы, присутствовавшие в первичном мазке. Г. Посев на питательные среды с целью получения изолированных колоний. Производят посев материала петлёй или шпателем методом механического разобщения на чашку с дифференциально-диагностической или селективной средой с целью получения изолированных колоний. После посева чашку переворачивают дном кверху (чтобы избежать размазывания колоний капельками конденсационной жидкости), подписывают и помещают в термостат при температуре 370С на 18-24 ч. Следует помнить, что при посевах и пересевах микробных культур внимание работающего должно быть обращено на соблюдение правил асептики для предупреждения контаминации питательных сред и предупреждения заражения окружающих и самозаражения! В случае инфекций, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами, где имеет значение количество присутствующих микроорганизмов в патологическом материале, делают количественный посев материала, для чего предварительного готовят ряд 100-кратных разведений материала (обычно 3 разведения) в стерильном изотоническом растворе хлорида натрия в пробирках. После чего по 50 мкл каждого разведения высевают на питательные среды в чашках Петри. 2 этап. А. Изучение морфотипов колоний на средах, их микроскопия. Просматривают чашки и отмечают оптимальную питательную среду, скорость роста, характер роста микроорганизмов. Для изучения выбирают изолированные колонии, расположенные по ходу штриха, ближе к центру. Если вырастает несколько типов колоний – каждый исследуется в отдельности. Оценивают признаки колоний (табл. 7). При необходимости чашки с посевами просматривают через лупу или с помощью микроскопа с объективом малого увеличения и суженной диафрагмой. Изучают тинкториальные свойства отличающихся морфотипов колоний, для этого из части исследуемой колонии готовят мазок, окрашивают по Граму или другими методами, микроскопируют и определяют морфологию чистоту культуры. При необходимости ставят ориентировочную РА на стекле с поливалентными сыворотками. Б. Накопление чистой культуры. Для накопления чистой культуры изолированные колонии всех морфотипов пересевают в отдельные пробирки со скошенным агаром или какой-либо другой питательной средой и инкубируют в термостате при +370С (такая температура оптимальна для большинства микроорганизмов, но может быть и другой, например, для Campylobacterium spp. – +420C, Candida spp. и Yersinia pestis – +250C). В качестве среды накопления для энтеробактерий обычно используют среду Клиглера. ^ МПА, 0,1% глюкозы, 1% лактозы, реактив на сероводород (сернокислое железо + тиосульфат натрия + сульфит натрия), индикатор феноловый красный. Изначальный цвет среды малиново-красный, среда «скошена» в пробирках: имеет столбик (2/3) и скошенную поверхность (1/3). Посев в среду Клиглера производится штрихом по поверхности и уколом в столбик. 3 этап. А. Учет роста на среде накопления, оценка чистоты культуры в мазке по Граму. Отмечают характер роста выделенной чистой культуры. Визуально чистая культура характеризуется однородным ростом. При микроскопическом исследовании окрашенного мазка, приготовленного из такой культуры, в нём в разных полях зрения обнаруживаются морфологически и тинкториально однородные клетки. Однако в случае выраженного плеоморфизма, присущего некоторым видам бактерий, в мазках из чистой культуры могут встречаться одновременно клетки с различной морфологией. Если в качестве среды накопления использовали индикаторную среду Клиглера, то оценивают изменения ее цвета в столбике и скошенной части, по которым определяют биохимические свойства: ферментацию глюкозы, лактозы и продукцию сероводорода. При разложении лактозы желтеет скошенная часть среды, при разложении глюкозы – желтеет столбик. При образовании CO2 в процессе разложения сахаров образуются газовые пузырьки или разрыв столбика. В случае продукции сероводорода отмечается почернение по ходу укола из-за превращении сульфата железа в сульфид железа. Характер изменения цвета среды Клиглера (рис. 23) объясняется неодинаковой интенсивностью расщепления микроорганизмами азотистых веществ и образования щелочных продуктов в аэробных (на скошенной поверхности) и анаэробных (в столбике) условиях. В аэробных условиях на скошенной поверхности происходит более интенсивное щелочеобразование, чем в столбике среды. Поэтому при разложении глюкозы, присутствующей в среде в небольшом количестве, образующаяся на скошенной поверхности кислота быстро нейтрализуется. В то же время при разложении лактозы, присутствующей в среде в высокой концентрации, щелочные продукты не способны нейтрализовать кислоту. В анаэробных условиях в столбике щелочные продукты образуются в ничтожном количестве, поэтому здесь выявляется ферментация глюкозы. |
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям