В. В. Аничкин (Гомель), С. Б. Мельнов (Минск), М. Е. Абраменко (Гомель), А. Д. Наумов (Гомель), Е. И. Барановская (Минск), В. Н. Беляковский (Гомель), И. А. Новикова (Гомель), В. Н. Бортновский (Гомель), Ю. П. Ос
|
|
Скачать 4.55 Mb.
|
|
^ 1. Крот, В. С. Причины некрозов при операциях с низведением сигмовидной кишки / В. С. Крот, А. Ф. Рылюк // Проблемы здоровья и экологии. — 2011. — № 2. — С. 55–60. 2. Дистальный край резекции в хирургии рака прямой кишки / Г. И. Воробьев [и др.] // Анналы хир. — 2001. — № 4. — С. 22–26. 3. Rectal cancer surgery in the elderly: a multivariate analysis of outcome risk factors / A. Bufalari [et al.] // J. Surg. Oncol. — 2006. — Vol. 93. — P. 173–180. 4. Prediction of Langenbecks Arch Surg / A. G. Heriot [et al.] // Postoperative mortality in elderly patients with colorectal cancer. Dis Colon Rectum. — 2007. — Vol. 49. — P. 816–824. 5. Fazio, V. W. Colonic «coloplasty»: novel technique to enhance low colorectal or coloanal anastomosis / V. W. Fazio, C. R. Mantyh, T. L. Hull // Dis. Colon. Rectum. — 2000. — Vol. 43. — P. 1448–145. Поступила 21.09.2011 УДК 616.155.34-074 ^ НЕЙТРОФИЛАМИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ Н. В. Гусакова, И. А. Новикова Гомельский государственный медицинский университет В культуральных исследованиях in vitro оценивали способность нейтрофилов крови здоровых лиц к образованию экстрацеллюлярных сетей в ответ на индукцию S. aureus или его растворимыми продуктами. Выявлена наиболее высокая активность живой культуры S. aureus (минимальная эффективная концентрация 107 КОЕ/мл) относительно других индукторов и определены оптимальные режимы инкубации — 150 минут при 37 °С. Ключевые слова: нейтрофильные экстрацеллюлярные сети, нейтрофилы. ^ N. V. Gusakova, I. A. Novikova Gomel State Medical University The cultural in vitro studies evaluated the ability of neutrophils to form extracellular traps in response to S. aureus induction or caused by its soluble factors in healthy individuals. The living culture of S. aureus (minimal effective concentration 107 CFU/ml) was revealed to be the most active in comparison with the other inductors. The optimal mode of incubation was 150 minutes at a temperature of 37 °C. ^ neutrophil extracellular traps, neutrophils. Введение Нейтрофильные гранулоциты для реализации своего антимикробного потенциала используют широкий набор факторов бактерицидности, наиболее изученными из которых являются гидролитические ферменты гранул, активные продукты кислорода и азота [1, 2]. В 2004 году учеными Института инфекционной биологии им. Макса Планка (Берлин, Германия) описан еще один механизм осуществления антимикробной функции нейтрофилов — формирование нейтрофильных экстрацеллюлярных сетей (НЭС) [3, 4]. Этим термином определяют способность нейтрофилов в ответ на микробные (S. aureus, E. coli, Lactobacterium spp., Bifidobacterium spp., S. flexneri, S. pyogenes, S. pneumoniae, B. anthracis) и немикробные (тромбоцитарные TLR4, липополисарид, форболмиристилацетат, ИЛ-8) стимулы формировать экстрацеллюлярные сетеподобные структуры, состоящие из ДНК и гидролитических ферментов (нейтрофильная эластаза, миелопероксидаза, протеиназа 3, катепсин G и др.) и обладающие бактерицидными свойствами [4, 5]. Процесс образования НЭС начинается с активации НАДФ — оксидазы, которая, в свою очередь, способствует выделению из азурофильных гранул и перемещению к ядру клетки нейтрофильной эластазы и миелопероксидазы, приводящих к повреждению ядерных гистонов и деконденсации хроматина. В дальнейшем ядерная мембрана разрушается и клетка быстро выбрасывает высокоактивную смесь наружу, образуя своеобразную сеть, в которую в последующем попадают бактерии [6]. В исследованиях in vitro продемонстрировано, что образование экстрацеллюлярных сетей в ответ на стимуляцию нейтрофилов начинает проявляться после 2-часовой инкубации [7]. Это дает основание предполагать, что в условиях организма формирование НЭС обеспечивает киллинг микробов в случае неэффективного фагоцитоза. Преимуществами НЭС как механизма бактерицидности является создание дополнительного физического барьера, препятствующего распространению патогенов (особенно являющихся слишком крупными для фагоцитоза), а также минимальные повреждения окружающих тканей [3]. Для изучения способности нейтрофилов к образованию экстрацеллюлярных сетей, как правило, используется краткосрочное культивирование нейтрофилов, выделенных на градиенте плотности, со стимулятором с последующей визуализацией образовавшихся структур путем микроскопии [4, 8]. Однако методологические подходы количественного определения НЭС для внедрения в клиническую практику в настоящее время не отработаны. Цель работы Разработка оптимальной клеточной модели для изучения способности нейтрофилов крови к формированию экстрацеллюлярных сетей. Материалы и методы Материалом для исследования служили лейкоциты периферической венозной крови 27 практически здоровых лиц в возрасте 19–45 лет. Лейкоциты получали путем отстаивания гепаринизированной крови (10 Ед / мл) в течение 45 минут при 37 °С, отбирали нижний слой плазмы с лейкоцитарной пленкой, количество нейтрофилов в суспензии доводили до концентрации 5×106 клеток / мл путем разведения необходимым количеством 0,9 % раствором NaCl. Жизнеспособность клеток по тесту исключения трипанового синего составляла не менее 95 %. Формирование экстрацеллюлярных сетей нейтрофилами оценивали методом люминесцентной микроскопии с использованием красителя акридинового оранжевого, избирательно окрашивающего нуклеиновые кислоты. Для индукции образования НЭС использовали живую либо инактивированную (нагревание до 60 °С в течение 1 часа) суточную культуру S. аureus (АТСС 25923) в различных концентрациях (104–109 КОЕ / мл), а в ряде исследований — растворимые продукты S. аureus. Выбор S. аureus в качестве стимулятора обусловлен универсальностью его применения в лабораторной практике для оценки различных проявлений функциональных свойств нейтрофилов (фагоцитоза, кислород-продуцирующей функции и др.) [9]. Количество микроорганизмов в суспензии контролировали по стандарту мутности по шкале McFarland. Для получения растворимых продуктов предварительно переносили одну полную стандартную бактериальную петлю суточной культуры S. aureus в 100 мл питательной среды RPMI-1640. Микробную взвесь инкубировали 24 часа при 37 °С, центрифугировали при 1000 g в течение 30 минут, надосадочную жидкость отбирали, пропускали через стерилизующий фильтр с диаметром пор 0,22 мкм и хранили до использования при — 20 °С. Лейкоцитарную суспензию инкубировали с равным объемом стимулятора в течение 30–180 минут при 37 °С, затем центрифугировали 5 минут при 250 g, из осадка готовили мазки, высушивали, фиксировали 96° этиловым спиртом и окрашивали 0,04 % водным раствором акридинового оранжевого в течение 2 минут в темноте. Контролем служили клетки, инкубируемые в тех же условиях без стимулятора. Учет проводили с помощью люминесцентного микроскопа ZEISS Axio Star plus HBO 50/AC (увеличение ×1000, фильтр возбуждения — 490 нм, фильтр эмиссии — 520 нм). Ядра нейтрофилов флуоресцировали ярко-зеленым цветом, нейтрофильные ловушки были представлены тонкими свободнолежащими ярко-зелеными нитями, занимающими пространство, в 2–3 раза превосходящее диаметр неизмененного нейтрофила. Учитывали четко дифференцируемые нейтрофильные экстрацеллюлярные сети, сосчитанные на 100 нейтрофилов. Статистический анализ проводился с использованием непараметрического W-критерия Вилкоксона. Различия считали значимыми при р < 0,05. Данные представлены в виде медианы (Ме) и интерквартильного размаха (25 %; 75 %). Результаты и обсуждение Формирование нейтрофилами экстрацеллюлярных сетей в зависимости от времени культивирования и концентрации живого ^ представлено в таблице 1. Таблица 1 — Количество НЭС (%) при стимуляции живой суспензией S. аureus (n = 27)
* Различия статистически значимы в сравнении с контролем, р < 0,05 Как видно из таблицы 1, в препаратах лейкоцитов крови здоровых лиц определяются в низком количестве экстрацеллюлярные сети (перцентильный размах 5–7). Культивирование нейтрофилов в условиях без добавления стимулятора в течение от 30 до 180 минут не приводило к увеличению их способности к образованию экстрацеллюлярных сетей. При внесении в культуру клеток суспензии живого S. аureus наблюдался значимый прирост количества НЭС, однако только на 150 минуте инкубации (р < 0,05 в сравнении с контролем). При этом минимальная эффективная концентрация живого S. aureus как стимулятора НЭС составила 107 КОЕ/мл (р < 0,05 относительно контроля). Повышение концентрации микробных тел до 109 КОЕ/мл, как и увеличение времени инкубации более 150 минут, не приводило к дальнейшему приросту количества НЭС. Полученные результаты согласуются с данными других исследователей, продемонстрировавших максимум образования экстрацеллюлярных сетей в культуре нейтрофилов периферической крови на 150 минуте инкубации [7]. Авторы предполагают, что это время необходимо для выхода из азурофильных гранул и перемещения к ядру клетки нейтрофильной эластазы и миелопероксидазы, приводящих к повреждению ядерных гистонов и деконденсации хроматина. Известно, что способность живых и инактивированных микробных частиц индуцировать функциональную активность нейтрофилов различается [10]. В значительной степени это объясняется инактивацией при нагревании термолабильных факторов патогенности S. aureus и более слабым стимулирующим эффектом на функциональную активность нейтрофилов сохраняющихся термостабильных компонентов (тейхоевые и липотейхоевые кислоты, энтеротоксины А, В, С, D, Е, экзотоксин TSST-1, эксфолиатин А) [2, 11, 12]. В наших исследованиях применение в качестве стимулятора взвеси инактивированного S. aureus оказывало значимый эффект на формирование НЭС в тех же концентрациях и временных интервалах, что и живые микроорганизмы, однако степень стимуляции была менее выраженной (таблица 2). Удобным для лабораторной практики является использование в качестве стимулятора функциональных свойств нейтрофилов вместо микроорганизмов их растворимых продуктов. Показано, что секреторные продукты стафилококков представляют собой комплекс высокоактивных веществ, которые в экспериментах in vitro повышают экспрессию рецепторов к С3-компоненту комплемента на нейтрофилах, генерируют продукцию ими ФНОα и ИЛ-1β, ИЛ-8, кислородных радикалов [2, 10]. В проведенных нами исследованиях, с использованием в качестве стимулятора растворимых продуктов S. aureus, обнаруживалось значимое увеличение количества НЭС в сравнении с контролем (р < 0,05) на 150 минуте инкубации (таблица 3). Таблица 2 — Количество НЭС (%) при стимуляции клеток инактивированным S. aureus (n = 27)
* Различия статистически значимы в сравнении с контролем, р < 0,05 Таблица 3 — Формирование нейтрофильных экстрацеллюлярных сетей под влиянием растворимых продуктов ^ (n = 27)
* Различия статистически значимы в сравнении с контролем, р < 0,05 При этом по выраженности эффекта растворимые продукты ^ занимали промежуточное положение между живой и инактивированной культурой микроорганизмов (рисунок 1). Максимальный стимулирующий эффект на образование НЭС выявлен при использовании в качестве индуктора суспензии живых S. aureus, минимальный — в ответ на стимуляцию инактивированными микробами.  ^ к формированию экстрацеллюлярных сетей в зависимости от стимулятора. Данные представлены в виде (Me: 25 %; 75 %; Min – Max). I — инкубация с растворимыми продуктами S. аureus; II — инкубация с живой взвесью ^ ; III — инкубация с инактивированной взвесью S. аureus. Время инкубации — 150 мин; концентрация S. аureus — 107 КОЕ/мл. * различие значимо в сравнении с аналогичным показателем I группы; ** различие значимо в сравнении с аналогичным показателем II группы Проведенные исследования позволили установить возможность использования лейкоконцентрата для оценки способности нейтрофилов к образованию НЭС, что значительно снижает трудоемкость исследования и делает его более физиологичным. Определены оптимальные режимы культивирования клеток при стимуляции формирования НЭС S. аureus либо его растворимыми продуктами. Эти исследования могут послужить основой для изучения функциональной активности нейтрофилов при различных формах стафилококковой инфекции, что позволит оптимизировать подходы к мониторингу и прогнозу таких состояний. ^ 1. Нестерова, И. В. Нейтрофильные гранулоциты — ключевые клетки иммунной системы / И. В. Нестерова, И. Н. Швыдченко, В. А. Роменская // Аллергология и иммунология. — 2008. — Т. 9, № 4. — С. 432–435. 2. Новикова, И.А. Показатели клеточного иммунитета и их изменение под влиянием растворимых продуктов S. aureus у больных гнойно-воспалительными заболеваниями / И. А. Новикова, Е. С. Головко, В. П. Булавкин // Проблемы здоровья и экологии. — 2008. — № 1. — С. 53–58. 3. Zychlinsky, A. NETs: a new strategy for using old weapons / A. Zychlinsky // Trends in Immunology. — 2009. — Vol. 30, № 11. — Р. 513–521. 4. Brinkmann, V. Neutrophil extracellular traps kill bacteria / V. Brinkmann // Science. — 2004. — Vol. 303. — Р. 1532–1535. 5. Нестерова, И. В. Нейтрофильные экстрацеллюлярные сети: протекция и защита / И. В. Нестерова // Международный журнал по иммунореабилитации. — 2009. — Т. 11, № 1. — С. 25–26. 6. Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidaze regulate the formation of neutrophil extracellular traps / A. Zychlinsky, K. D. Metzler // The Journal of Cell Biology. — 2010. — Vol. 25. — Р. 1–15. 7. Fuchs, T. A. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps / T. A. Fuchs // The Journal of Cell Biology. — 2007. — Vol. 176. — Р. 231–241. 8. Долгушин, И. И. Технологии определения и роль нейтрофильных внеклеточных ловушек в антимикробной защите / И. И. Долгушин, Ю. С. Шишкова, А. Ю. Савочкина // Вестник РАМН. — 2010. — № 4. — С. 26–30. 9. Тотолян, А. А. Клетки иммунной системы / А. А. Тотолян, И. С. Фрейдлин. — СПб.: Наука, 2000. — 231 с. 10. Veldkamp, K. E. Modulation of neutrophil chemokine receptors by S. aureus supernate / K. E. Veldkamp, J. M. Heezius, J. Verhoef // Infection and Immunity. — 2000. — Vol. 68, № 10. — Р. 5908–5913. 11. Афанасьева, Е. С. Оценка чувствительности CD2 рецепторов лимфоцитов к растворимым продуктам S. aureus / Е. С. Афанасьева // Сб. науч. ст. Респ. науч.-практ. конф. «Актуальные вопросы теоретической и практической медицины», посвященной 15-летию образования Гомельского государственного медицинского университета / Гомельский государственный медицинский университет. — Гомель, 2005. — Т. 1. — С. 12–15. 12. Пронин, А. В. Суперантигены — факторы патогенности или стимуляторы иммунитета / А. В. Пронин // Медицинская иммунология. — 2005. — Т. 7, № 5–6. — С. 453–460. Поступила 30.09.2011 УДК 616-03:616-035.2 ^ СЫВОРОТКИ КРОВИ И ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА И. В. Жильцов, Д. В. Моисеев, В. М. Семенов, С. К. Егоров ^ Настоящая работа посвящена актуальной проблеме исследования влияния факторов сыворотки крови человека на бета-лактамы. Показано, что гидролиз четырех антибиотиков бета-лактамного ряда (бензилпенициллина, цефалексина, азтреонама и имипенема) под воздействием человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) статистически значимо ускоряется, что обусловливает дополнительный распад 2,3 % азтреонама, 7,5 % бензилпенициллина, 10,8 % цефалексина и 11,9% имипенема к шестому часу инкубации при 37 °С. При этом вид кинетических кривых распада бензилпенициллина, цефалексина и имипенема под воздействием ЧСА типичен для ферментативных реакций первого порядка, а азтреонама – нулевого порядка. Повышение температуры инкубации с 37 до 39 °С приводит к ускорению катализируемого альбумином распада имипенема в среднем на 14 %, а цефалексина — на 15,7 %. Бета-лактамные антибиотики, не разрушающиеся под воздействием ЧСА, не разрушаются и цельной сывороткой крови. По отношению к бета-лактамным антибиотикам, разрушаемым ЧСА, нативная сыворотка крови может проявлять существенно более высокую (разница может превышать 30 %) бета-лактамазную активность, чем очищенные препараты альбумина любого происхождения в нормальной для человеческой крови концентрации. Таким образом, сыворотка крови может разрушать некоторые бета-лактамные препараты, широко используемые в практике здравоохранения. ^ бета-лактамные антибиотики, человеческий сывороточный альбумин, сыворотка крови, бета-лактамазная активность, высокоэффективная жидкостная хроматография. ^ OF NATIVE BLOOD SERUM AND HUMAN SERUM ALBUMIN I. V. Zhyltsov, D. V. Moiseyev, V. M. Semionov, S. K. Yegorov Vitebsk State Medical University The present work is dedicated to the important problem of the impact which the factors of human blood serum exert on beta-lactams. It has been shown that human serum albumin (HSA) accelerates hydrolysis of four beta-lactams (namely, benzylpenicillin (BP), cefalexin, aztreonam and imipenem). This acceleration becomes more statistically intensive and stipulates the additional decay of 7,5 per cent BP, 10,8 per cent cefalexin, 2,3 per cent aztreonam and 11,9 per cent imipenem by the sixth hour of incubation at a temperature of 37 °С. Meanwhile, the state of the kinetic curves of BP, cefalexin and imipenem after their decay caused by human blood serum is typical for the first-order enzymatic reactions, and aztreonam — for zero order. The increase of the incubation temperature from 37 to 39 °С leads to the fourteen-percent accelerated decay of albumin-catalyzed imipenem, and that of cefalexin — by 15,7 %. The beta-lactam antibiotics that are not destroyed by HSA cannot be degraded by the whole blood serum. If a beta-lactam antibiotic is capable of being hydrolyzed by HSA, native blood serum may show much higher beta-lactamase activity (above 30 % of additional decay for BP) than any purified HSA preparations of any origin in concentrations that are normal for human blood serum. Thus, human blood serum can destroy some beta-lactam antibiotics that are widely used in health care, which presents a definite clinical importance. ^ beta-lactam antibiotics, human serum albumin, native blood serum, beta-lactamase activity, HPLC. Введение Феномен собственной бета-лактамазной активности человеческой крови известен достаточно давно. Так, было показано, что аналоги карбапенемов разрушаются альбуминами человеческой крови [1]. В 1972 г. группа исследователей компании Glaxo Research Ltd, изучая свойства синтезированного ими антибиотика нитроцефина, описала значимый распад бета-лактамной связи последнего под воздействием, в числе прочего, сыворотки человеческой крови, причем было показано, что данное ее свойство опосредуется в первую очередь альбуминовой фракцией [2]. Тем не менее углубленное исследование данного феномена на тот момент не производилось, реакция была сочтена неспецифической, и обнаруженное явление было забыто на много лет. В 1994 г. научный коллектив во главе с B. Nerli повторно описал феномен интенсивного распада нитроцефина под воздействием человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) [3, 4]. Попытка выявить распад некоторых других антибиотиков цефалоспоринового ряда под воздействием ЧСА не увенчалась успехом, и в результате феномен необычно высокой собственной бета-лактамазной активности человеческой крови остался незамеченным научным сообществом. В 2007 г. явление необычно интенсивного распада нитроцефина под воздействием сыворотки человеческой крови было независимо от других исследователей обнаружено нашим научным коллективом [5]. Ранее мы убедительно доказали, что бета-лактамазная активность — неотъемлемое свойство человеческой крови, и она на 86–100 % обусловлена ее альбуминовой фракцией. Помимо ЧСА, большинство белковых фракций крови обладает незначительной бета-лактамазной активностью, составляющей приблизительно 9,6 % от общей сывороточной. В частности, поликлональные IgG также обладают собственной бета-лактамазной активностью, но их вклад в общую сывороточную активность не превышает 10–15 %. Нами был описан ряд особенностей сывороточной бета-лактамазной активности, в частности, оптимум рН, зависимость скорости реакции от температуры и ионной силы раствора, была изучена кинетика реакции распада нитроцефина, катализируемого ЧСА. Было также установлено, что наличие бета-лактамазной активности ЧСА критически зависит от сохранности третичной структуры последнего и в то же время не зависит от присутствия кофакторов. Мы доказали наличие в составе молекулы альбумина активного центра, ответственного за связывание бета-лактамных антибиотиков и разрушение нитроцефина, смоделировали его трехмерную структуру и аминокислотный состав, а также реконструировали механизм катализа [6, 7]. Тем не менее остается открытым вопрос: может ли ЧСА катализировать гидролиз бета-лактамной связи каких-либо антибиотиков, кроме нитроцефина? Согласно имеющимся публикациям, такую возможность нельзя исключить [1], но конкретных данных о характере воздействия ЧСА на антибиотики бета-лактамного ряда нет до сих пор. Цель исследования Изучение взаимодействия ЧСА с наиболее широко применяемыми в клинической практике антибиотиками бета-лактамного ряда. Материалы и методы Определялась бета-лактамазная активность препарата ЧСА, очищенного спиртовой седиментацией по Кону [8] на Витебской областной станции переливания крови. Рабочая (в пробе) концентрация альбумина составляла 50 мг/мл. Для исследования взаимодействия антибиотиков бета-лактамного ряда с сывороткой крови и ЧСА мы использовали высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ). Данный метод не позволяет непосредственно регистрировать факт распада бета-лактамной связи антибиотика, фиксируя лишь убыль количества анализируемого вещества, но существуют способы обойти данное ограничение. Для выполнения ВЭЖХ-анализа использовался жидкостный хроматограф Agilent 1100 с фотодиоднометрическим детектором G1315B и системой автоматического ввода пробы (автосэмплером). Разделение производилось на хроматографической колонке Zorbax Eclipse XDB-C18 150×4,6 мм (размер частиц сорбента — 5 μm). В качестве подвижной фазы (элюента) применялась смесь ацетонитрила (пр-во Sigma) и 0,01 М KH2PO4 (pH 3,0), температура колонки составляла 30 °С, давление в системе — 150–170 бар. Соотношение ацетонитрила и буферного раствора подбиралось таким образом, чтобы общее время одного анализа не превышало 15 минут, а время удерживания антибиотика составляло не менее 5 минут. Для эксперимента было использовано 13 антибиотиков бета-лактамного ряда, все — химически чистые субстанции, произведенные Sigma либо Vetranal: азтреонам (CAS 78110–38–0), амоксициллин (CAS 26787–78–0), ампициллин (CAS 69–52–3), бензилпенициллин (CAS 69–57–8), имипенем (CAS 74431–23–5), пиперациллин (CAS 59703–84–3), цефалексин (CAS 15686–71–2), цефокситин (33564–30–6), цефоперазон (CAS 113826–44–1), цефотаксим (CAS 64485–93–4), цефтазидим (MDL MFCD 00153936), цефтриаксон (CAS 104376–79–6), цефепим (CAS 88040–23–7). Соотношение концентраций антибиотиков и ЧСА (во всех случаях 1 моль/л) составляло 1:1. В качестве контрольных проб использовались рабочие растворы антибиотиков, разведенные в 2 раза 0,1 М ФБР, рН 7,4. Контрольные и опытные пробы инкубировались при 37 °С в течение 3240 минут, причем содержание исследуемых антибиотиков в них замерялось перед началом инкубации, затем — каждые 15 минут в течение первого часа инкубации, затем — каждые 30 минут в течение 2 часа инкубации, затем — каждый час до 6 часов инкубации, после чего — на 1440, 1800, 2940 и 3240 минутах. По результатам замеров вычислялась доля антибиотика (в процентах от количества, исходно внесенного в пробу), содержащаяся в каждой паре проб на момент регистрации хроматограммы, и на основании полученных данных строились кривые убыли антибиотиков. Достоверность различий убыли антибиотиков в парах опытных и контрольных проб определялась при помощи F-теста с использованием программы GraphPad Prism 5. Перед загрузкой смеси ЧСА с изучаемым антибиотиком на ВЭЖХ-колонку производилась депротеинизация раствора путем добавления метанола (х.ч.) [10]. Согласно полученным нами ранее данным [6, 7], повышение температуры до физиологически допустимых цифр, наблюдаемых у высоко лихорадящих больных (39–40 °С), приводит к существенному повышению уровня гидролиза нитроцефина под воздействием ЧСА. Мы предположили, что эта закономерность распространяется не только на данную реакцию, но и на катализируемый ЧСА распад остальных бета-лактамных препаратов. С целью экспериментальной проверки указанного предположения были приготовлены две серии контрольных и опытных проб одинакового состава; одна серия инкубировалась при 37 °С, вторая — при 39 °С. В качестве субстратов были использованы химически чистые субстанции имипенема и цефалексина. Содержание антибиотиков в пробах определялось при помощи ВЭЖХ; в дальнейшем производилось сравнение количества антибиотиков, выявленного в опытных и контрольных пробах на определенный момент времени. Достоверность различий убыли антибиотиков в парах опытных и контрольных проб определялась с помощью F-теста. Для доказательства факта распада бета-лактамной связи бензилпенициллина (БП) в процессе взаимодействия с ЧСА к рабочему раствору БП добавлялось 100 ЕД пенициллиназы (ФС 42–2059–92), затем производилось ВЭЖХ-определение количества БП в пробе непосредственно после внесения пенициллиназы и через 30 минут инкубации при комнатной температуре (22 °С). Время удержания продуктов распада, образовавшихся вследствие воздействия пенициллиназы, в дальнейшем сравнивалось со временем удержания продуктов распада, образовавшихся в результате взаимодействия БП и ЧСА. Поскольку все вышеописанные эксперименты производились с очищенным препаратом ЧСА, возник вопрос о реальной доле вклада остальных белковых фракций сыворотки крови в ее суммарную бета-лактамазную активность. Данный вопрос уже поднимался ранее и был решен для реакции гидролиза нитроцефина: вклад глобулиновой фракции (в частности, поликлональных IgG) в суммарное количество разрушаемого нативной сывороткой крови нитроцефина в основном не превышает 10–15 % [6, 7]. Тем не менее ситуация с остальными бета-лактамными антибиотиками требует прояснения, поскольку ранее нами было доказано, что и механизм катализа, и кинетика реакции их распада могут существенно отличаться от таковых для нитроцефина. В связи с этим мы провели эксперимент по оценке вклада неальбуминовых фракций сыворотки крови в процесс гидролиза БП и цефтриаксона. Выбор пал на указанные антибиотики, поскольку ранее был строго доказан факт гидролиза бета-лактамной связи БП под воздействием ЧСА, равно как и полное отсутствие гидролиза цефтриаксона в аналогичных условиях. Оба антибиотика чрезвычайно широко применяются в клинической практике в качестве средств для стартовой антибактериальной терапии и являются типичными представителями своих групп (природные пенициллины и парентеральные цефалоспорины 3-го поколения соответственно). При изучении распада указанных бета-лактамных антибиотиков под воздействием нативной сыворотки крови использовались 2 образца сыворотки, отличающиеся высокой собственной бета-лактамазной активностью (оба получены от больных с инфильтративным туберкулезом легких). Кроме того, для сравнения с ЧСА спиртовой очистки в данном эксперименте нами был использован препарат ЧСА особо высокой чистоты производства «Sigma». Результаты и обсуждение Оказалось, что большая часть изученных антибиотиков (ампициллин, цефоперазон, пиперациллин, цефтазидим, цефтриаксон, цефотаксим и цефокситин) не взаимодействует с ЧСА: кривые их распада с течением времени в опытных (с альбумином) и контрольных (самораспад) пробах оказались практически идентичными, а разница между ними — статистически незначимой. В то же время распад 4 антибиотиков (бензилпенициллина, цефалексина, азтреонама и имипенема) под воздействием ЧСА статистически значимо (во всех случаях р < 0,0001) ускорялся по сравнению со спонтанным распадом в контрольных пробах. Примечательно, что и имипенем, и азтреонам разрушаются лишь немногими бета-лактамазами бактерий, в частности, карбапенемазами (имипенем), а также БЛРС из функциональной группы 2be (азтреонам). Графики убыли концентрации бензилпенициллина, цефалексина и имипенема в опытных пробах имеют экспоненциальный вид. Подобная форма кинетических кривых характерна для реакций 1-го порядка, типичных для истинных ферментов. В случае же азтреонама имеет место реакция нулевого порядка, скорость которой не зависит от концентрации субстрата, поскольку график убыли концентрации данного препарата имеет линейный вид. По смоделированному нами процессу, к 6 часу с момента введения обсуждаемых антибиотиков в человеческий организм их взаимодействие с ЧСА приводит к гидролизу дополнительных (плюс к уровню самораспада) 2,3 % азтреонама, 7,5 % бензилпенициллина, 10,8 % цефалексина и 11,9 % имипенема. Таким образом, бета-лактамазная активность альбумина может обусловливать распад значимых количеств бета-лактамных препаратов, реально применяемых в клинической практике, тем самым снижая их клиническую эффективность. Повышение температуры с 37 до 39 °С приводит к ускорению распада имипенема в среднем на 14 % (максимальная разница — 33,3 % наблюдалась к 6 часу инкубации), а цефалексина — в среднем на 15,7 % (данная разница оставалась практически неизменной на протяжении всего срока инкубации). Выявленные различия являлись статистически значимыми (для имипенема р < 0,0001, для цефалексина р = 0,0016). Напомним, что повышение температуры инкубации с 36 до 39 °С приводит к распаду дополнительных 11,5 % нитроцефина; таким образом, полученные данные хорошо согласуются между собой [6, 7]. Можно сделать вывод, что у лихорадящих больных с температурой тела 39 °С и более распад бета-лактамных антибиотиков под воздействием ЧСА существенно ускоряется, что должно приводить к снижению их клинической эффективности и требует, как минимум, коррекции используемых доз в сторону увеличения. Добавление 100 ЕД пенициллиназы к рабочему раствору БП с последующей регистрацией хроматограммы показало, что время удержания единственного образующегося при этом продукта распада (2,7 минуты) в точности соответствует времени удержания единственного продукта распада, образующегося при взаимодействии БП с ЧСА (также 2,7 минуты). Таким образом, можно считать доказанным, что при взаимодействии ЧСА и БП происходит гидролиз последнего по бета-лактамной связи, как и при воздействии пенициллиназ. Анализ взаимодействия БП и цефтриаксона с нативной сывороткой крови показал, что: 1) цефтриаксон не разрушается под воздействием нативной сыворотки крови (как и под воздействием ЧСА); 2) нативная сыворотка крови гидролизует БП существенно быстрее по сравнению с ЧСА; в среднем разница в уровнях бета-лактамазной активности сыворотки крови и чистого альбумина составила 12,2 процентных пункта в пользу сыворотки (U-тест Манна-Уитни, р = 0,0053). Можно сделать вывод, что нативная сыворотка крови в некоторых случаях демонстрирует бета-лактамазную активность, превышающую активность ЧСА (в нормальной для человеческой крови концентрации) до 32,5 %, то есть фактически на треть. Следует особо отметить, что активность обоих использованных в эксперименте препаратов ЧСА (полученного спиртовой седиментацией по Кону на Витебской областной станции переливания крови и особо высокой очистки пр-ва «Sigma») в отношении БП оказалась абсолютно идентичной. Убыль количества БП в пробах под воздействием нативной сыворотки крови носит экспоненциальный характер с постепенным выходом на плато (как и в случае с обоими препаратами ЧСА). Подобный вид кинетической кривой характерен для реакции первого порядка, типичной для пенициллиназ. Заключение 1. С помощью современного метода ВЭЖХ доказано, что распад четырех антибиотиков бета-лактамного ряда (бензилпенициллина, цефалексина, азтреонама и имипенема) под воздействием ЧСА статистически значимо ускоряется. Таким образом, бета-лактамазная активность альбумина может обусловливать распад бета-лактамных антибиотиков, широко применяемых в клинической практике, тем самым снижая их клиническую эффективность. 2. У лихорадящих больных с температурой тела 39°С и выше распад бета-лактамных антибиотиков под воздействием ЧСА существенно ускоряется, что приводит к дополнительному снижению их клинической эффективности. 3. Бета-лактамные антибиотики, не разрушающиеся под воздействием ЧСА, не разрушаются и цельной сывороткой крови. По отношению к бета-лактамным антибиотикам, разрушаемым ЧСА, нативная сыворотка крови в некоторых случаях может проявлять существенно более высокую бета-лактамазную активность, чем очищенные препараты альбумина любого происхождения в аналогичной концентрации. Данная разница в активности обусловлена вкладом глобулиновых белковых фракций сыворотки крови. |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям